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INRA Prod. Anim., 2000, numéro hors série « Génétique moléculaire : principes e

INRA Prod. Anim., 2000, numéro hors série « Génétique moléculaire : principes et application aux populations animales », 45-53. F. PITEL, J. RIQUET INRA Laboratoire de Génétique Cellulaire, BP 27, 31326 Castanet-Tolosan cedex e-mail : pitel@toulouse.inra.fr Les marqueurs anonymes et la détection de leur polymorphisme 2 - Polymorphismes génétiques Résumé. Les marqueurs génétiques les plus utilisés actuellement en génétique animale sont présentés, sans que soient développées dans le détail toutes les techniques mises en oeuvre. Nous distinguons les marqueurs utilisés avant la PCR (Polymerase Chain Reaction) et ceux qui sont employés depuis. Les marqueurs actuels sont également présentés en deux groupes : ceux qui sont utilisés pour une approche globale du génome et ceux que l’on emploie dans des approches ponctuelles, en distinguant la mise en évidence d’un polymorphisme et son exploitation à gran- de échelle. Nous évoquons enfin les SNP (Single Nucleotide Polymorphism), qui seront proba- blement des marqueurs très utilisés dans l’avenir grâce à la technologie des ‘puces à ADN’. Il existe d’autres types de marqueurs que les mar- queurs moléculaires et d’autres manières de les localiser que la cartographie génétique. Nous ne nous intéresserons ici qu’aux marqueurs les plus utilisés en génétique moléculaire : les marqueurs génétiques existant sur l’ADN. Ce sont des frag- ments d’ADN, correspondant à des locus, pour les- quels il existe dans le génome d’une espèce plu- sieurs formes, plusieurs allèles : c’est le polymor- phisme. On peut les classer en deux grands types : les motifs répétés - pour lesquels le polymorphisme repose sur la variation entre allèles du nombre de répétitions d’une même séquence courte d’ADN - et les mutations ponctuelles (ou SNP : Single Nucleotide Polymorphism) - auxquelles on peut adjoindre les insertions/délétions - pour lesquelles le polymorphisme repose sur des changements de constitution de la séquence d’ADN (remplacement d’une base par une autre, insertion ou délétion d’un fragment de quelques paires de bases). Les sources de polymorphismes sont présentées en détail dans le texte de L. Schibler (2000, cet ouvrage). En fonction du type d’analyse que l’on veut effec- tuer (détection d’un polymorphisme ponctuel, exploitation à grande échelle de ce polymorphisme, observation de l’ensemble du génome...), l’un ou l’autre type de marqueurs est utilisé. De plus, le même type de marqueur peut être analysé par diffé- rentes techniques, là encore suivant l’échelle du programme à mener à bien. Par abus de langage, on confond ainsi en général le marqueur étudié avec la technique utilisée pour le mettre en évidence : c’est le cas dans la suite de ce texte, qui est loin d’être exhaustif, mais présente les techniques d’analyse de polymorphisme qui nous semblent les plus impor- tantes. Notons que certaines techniques ont plu- sieurs acronymes différents (notamment dans le domaine végétal), seuls les plus courants sont utili- sés dans cet article. Des détails concernant ces dif- férentes techniques sont disponibles dans les ouvrages répertoriés dans les références bibliogra- phiques figurant à la fin de ce texte. Les utilisations de ces marqueurs (élaboration des cartes génétiques, recherche de QTL, sélection assistée par marqueurs, contrôle de filiation, études de diversité génétique,...) sont présentées dans la suite de l’ouvrage. 1 / Les marqueurs les plus utili- sés avant la PCR Les deux types de marqueurs génétiques décrits dans ce paragraphe ont été très employés avant la mise au point de la technique de PCR (Polymerase Chain Reaction). Ils ont été utilisés pour construire les premières cartes génétiques, mais ne sont main- tenant employés que de manière occasionnelle, dans le cadre de programmes précis. Tous deux reposent sur l’utilisation de la tech- nique de Southern blot. L’ADN génomique est digé- ré, les fragments sont séparés en fonction de leur longueur par électrophorèse. Les fragments d’ADN sont ensuite dénaturés in situ, pour être transférés à l’état simple brin sur membrane. Ils sont alors mis en présence d’une sonde qui viendra s’hybrider avec les fragments d’ADN dont la séquence est en partie complémentaire de la sonde. Cette sonde est géné- ralement radioactive, ce qui permet, après révéla- tion autoradiographique, d’obtenir un profil de bandes spécifiques. Si la sonde utilisée est spéci- fique d’un locus unique (monolocus), on parlera de marqueur RFLP, si, en revanche, la sonde corres- pond à un motif répété, on révélera des marqueurs de type minisatellite. 46 / F. PITEL, J. RIQUET INRA Productions Animales, 2000, hors série Génétique moléculaire 1.1 / RFLP Les RFLP (pour Restriction Fragment Length Polymorphism) sont des marqueurs de type «muta- tion/insertion/délétion». Leur détection repose sur les différences éventuelles de longueur des frag- ments obtenus après digestion de l’ADN génomique par une enzyme de restriction (figure 1). A l’aide d’une sonde monolocus, le profil obtenu sera composé d’une ou quelques bandes, en fonc- tion de la longueur de la sonde et du nombre de sites de restriction présents sur l’ADN génomique dans la région étudiée (au sein du fragment corres- pondant à la sonde, ou dans les séquences flan- quantes). Toute insertion ou délétion entre deux sites enzymatiques engendre des différences de taille des fragments de restriction (sur la figure, pro- fil généré par l’enzyme A), de même que toute muta- tion dans le site de coupure (profil généré par l’en- zyme B). On a ainsi, en général, des marqueurs monolocus, bialléliques (présence ou absence du site de restric- tion), codominants. 1.2 / Minisatellites Si la sonde est multilocus (sa séquence se retrou- ve en différents endroits du génome), le profil obte- nu est composé d’un grand nombre de bandes. Les sondes utilisées dans ce cas sont des répétitions d’un motif d’une dizaine à une cinquantaine de bases. Ces séquences, appelées aussi VNTR (Variable Number of Tandem Repeats), sont pré- sentes plusieurs fois dans le génome - bien que sou- vent réparties de manière non homogène - et sont très polymorphes, en raison de la variation du nombre de répétitions. Cependant, les polymor- phismes de type minisatellite sont en général analy- sés de la même manière qu’un RFLP, et il est sou- vent impossible de déterminer dans le profil obtenu les bandes allèles. Leur gros avantage réside dans la Allèle 1 Allèle 2 A B B A B A B A B Insertion de 200 pb Sonde radioactive 2000 pb (1800 + 200) 600 pb 400 pb 1800 pb 1000 pb 1 2 1 1 1 2 2 2 2 2 1 1 Enzyme A Enzyme B 2000 1800 1000 600 400 Figure 1. Principe de mise en évidence de RFLP bi-allélique par la méthode de Southern blot : l’ADN génomique total des individus analysés est digéré par différentes enzymes (A et B) ; après migration sur gel d’agarose et transfert sur membrane, les produits de la digestion sont hybridés à l’aide d’une sonde radioactive correspondant au locus étudié. Tout fragment digéré homologue d’une partie de la sonde sera révélé sur l’autoradiographie. L’enzyme A permet de révéler un polymorphisme de type insertion, l’enzyme B correspond à un polymorphisme de type substitution, induisant la perte d’un site de reconnaissance de B dans l’allèle 2. F1 F1 Figure 2. Exemple d’empreinte génétique obtenue par hybridation de différents individus (un bélier croisé à deux femelles ayant chacune un petit) avec une sonde minisatellite. détection simultanée d’un grand nombre de locus différents (figure 2). Ainsi, bien que les minisatellites soient plus poly- morphes que les RFLP classiques grâce à leur natu- re répétée, la technique utilisée pour les analyser fait que ces marqueurs sont pour la plupart multilo- cus, bialléliques, dominants. 2 / Les marqueurs les plus utili- sés après la PCR A partir de 1987, la PCR a permis de s’affranchir, dans la plupart des cas, de l’utilisation des Southern blots, et a ouvert la porte à d’autres types d’ana- lyses. Le choix des techniques pour la détection et l’ex- ploitation des polymorphismes dépend du type d’analyse du génome que l’on veut mettre en oeuvre : pour «cribler» le génome dans son ensemble - Les marqueurs anonymes et la détection de leur polymorphisme / 47 INRA Productions Animales, 2000, hors série Génétique moléculaire recherche de QTL par exemple - on utilisera des marqueurs répartis tout au long des chromosomes ; pour s’intéresser à une région particulière du géno- me, on recherchera essentiellement des polymor- phismes ponctuels localisés dans la zone d’intérêt. 2.1 / Approche globale a / Microsatellites Le polymorphisme de type VNTR à motif répété court (2 à 4 pb) a pu être analysé par PCR au moyen d’amorces choisies de part et d’autre de la répétition (figure 3). Les microsatellites, monolocus, multialléliques et codominants, sont devenus les marqueurs de prédilec- tion en génétique humaine et murine, puis pour la car- tographie des génomes des animaux domestiques : très polymorphes, bien répartis sur le génome, d’ana- lyse «facilement» automatisable, ils sont à l’origine de toutes les cartes génétiques mises en place et utilisées actuellement. Chaque couple d’amorces amplifiant un locus précis, ils entrent également dans les études plus restreintes de régions du génome impliquées dans des caractères particuliers. Ces marqueurs sont évoqués tout au long de cet ouvrage, puisqu’ils interviennent dans la plupart des domaines de la génétique uploads/Marketing/ 3810-texte-de-l-x27-article-29189-1-10-20200622-pdf.pdf