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Quantiﬁcation des acides nucléiques par PCR quantitative en temps réel C. Tse J

Quantiﬁcation des acides nucléiques par PCR quantitative en temps réel C. Tse J. Capeau Hôpital Tenon, Laboratoire de biochimie et d’hormonologie, 4, rue de la Chine, 75020 Paris Article reçu le 5 novembre 2002, accepté le 26 novembre 2002 Résumé. La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) est devenue un outil essentiel en biologie moléculaire et son application à la détection des acides nucléiques a révolutionné l’analyse quantitative des gènes et de leurs messagers. Ce concept technologique a rapidement évolué au cours de ces dernières années, et le nombre croissant des applications quantitatives de la PCR a contribué au développement de la PCR quantitative en temps réel. Cette revue décrit, après un bref rappel portant sur les bases mathématiques de la PCR, les principes de base de la quantiﬁcation par PCR en temps réel (nouveau concept du cycle seuil) ainsi que ceux des chimies les plus employées pour la détection en tube clos des acides nucléiques (chimie SYBRTM Green I et chimies utilisant les sondes ﬂuorogéni- ques, sondes TaqManTM, sondes FRET en tandem et sondes BeaconTM). Elle discute des différentes stratégies de quantiﬁcation et compare les systèmes de PCR quantitative en temps réel actuellement en compétition sur le marché. Les principales applications en biologie médicale sont également décrites. Mots clés : PCR, PCR en temps réel, cycle seuil, sonde ﬂuorogénique Summary. The polymerase chain reaction (PCR) has become an essential tool for molecular biologists and its introduction into nucleic acids detection systems has revolutionized the quantitative analysis of DNA and RNA. The technique has rapidly evolved over the last few years and the growing interest in quantitative applications of the PCR has favoured the development of real-time quantitative PCR. In this paper, we review, after presentation of the theorical aspects of PCR, the basic principles of real-time PCR with the introduction of the concept of threshold cycle. More precisely, we describe the novel assay formats that greatly simplify the protocols used for the detection of speciﬁc nucleic acids. We focus on the actual four technologies that enable sequence detection in a closed tube and that are SYBRTM Green I, TaqManTM probes, Hybridization probes and Molecular BeaconTM probes. We then discuss the different quantiﬁcation stra- tegies in real time PCR and compare the competiting instruments on the market. The most important real-time PCR applications in clinical biology are also described. Key words: PCR, real time PCR, threshold cycle, ﬂuorogenic probe Le concept technologique de la réaction de polymérisation en chaîne (polymerase chain reaction ou PCR), découvert par Kary Mullis en 1983 [1] et qui lui a valu le prix Nobel de chimie en 1993, est aujourd’hui devenu un outil quasiment universel dans le domaine de la biologie. La PCR est une méthodologie hautement sensible et spéciﬁque pour la dé- tection des acides nucléiques. Son usage s’est considérable- ment étendu à de nombreuses applications, dont l’analyse quantitative d’acides nucléiques spéciﬁques (ADN et ADNc) dans un échantillon donné. Les premières approches de quantiﬁcation de gènes par PCR ou de transcrits géniques par rétrotranscription PCR (RT-PCR) ont reposé sur une analyse de titration faisant appel à l’utilisation d’une solution titrée d’acide nucléique Tirés à part : C. Tse revue générale abc Ann Biol Clin 2003, 61 : 279–93 Ann Biol Clin, vol. 61, n° 3, mai-juin 2003 279 (ou standard externe) servant à l’élaboration d’une gamme d’étalonnage obtenue par dilutions en série du standard externe [2]. Le résultat de l’analyse donne une évaluation de la quantité relative de matrice cible par rapport au standard. Cependant, la précision des résultats obtenus est très souvent limitée, du fait de la grande variabilité d’efﬁ- cacité d’une PCR à l’autre. L’introduction d’un standard interne coampliﬁé au cours de la même réaction PCR a permis de corriger en partie la variabilité tube à tube et a conduit au développement de deux méthodologies différen- tes de quantiﬁcation : celles par PCR différentielle et celles par PCR compétitive. Dans les approches de quantiﬁcation par PCR (ou RT-PCR) différentielle [3], une séquence endogène, c’est-à-dire ap- partenant à un gène dit de référence présent dans l’échan- tillon testé (séquence endogène d’un gène présent à l’état d’une seule copie par génome haploïde ou transcrit d’un gène domestique dont la transcription est constante et indé- pendante de l’environnement extracellulaire), sert de stan- dard interne. La séquence endogène standard est coampli- ﬁée avec la séquence cible au cours d’une même réaction PCR utilisant deux couples d’amorces spéciﬁques. La mé- thode permet d’évaluer la quantité relative de gène cible par rapport au gène de référence, ce dernier permettant de normaliser la quantité et la qualité d’acide nucléique ex- trait. Néanmoins, la quantiﬁcation à l’aide d’un gène endo- gène comme standard interne nécessite des conditions d’application extrêmement normalisées aﬁn de s’assurer que l’ampliﬁcation des deux séquences différentes (gène cible et gène de référence) s’effectue avec des efﬁcacités identiques. Les approches de quantiﬁcation par PCR (ou par RT-PCR) compétitive utilisent une séquence exogène comme stan- dard interne [4]. Ce type d’approche repose sur une coam- pliﬁcation compétitive de la séquence cible avec des quan- tités connues de standard interne et en présence du même couple d’amorces. Le standard interne (ou compétiteur) est une séquence exogène d’ADN ou d’ARN synthétique que l’on construit de façon à être la plus proche possible de la séquence cible à quantiﬁer, qui doit partager les mêmes sites d’amorçage que la séquence cible, qui doit être ampli- ﬁé avec une efﬁcacité d’ampliﬁcation équivalente à celle de la séquence cible et dont le produit d’ampliﬁcation doit cependant pouvoir en être différencié [5]. La quantiﬁcation s’effectue par comparaison du signal PCR correspondant au gène cible avec ceux qui sont obtenus pour chaque concentration du gène compétiteur. Cependant, le choix du compétiteur et la validation des efﬁcacités d’ampliﬁcation sont difﬁciles à établir et relativement laborieux. L’autre limite des techniques de PCR compétitive est la nécessité de coampliﬁer par échantillon, au moins 4 ou 5 dilutions du standard interne pour couvrir le domaine des concentra- tions attendues en gène cible. Le nombre élevé de stratégies de quantiﬁcation proposées dans la littérature reﬂète bien la difﬁculté à obtenir des résultats ﬁables et reproductibles. L’introduction d’une molécule reporter ﬂuorescente dans le milieu réactionnel de PCR et la détection des produits de PCR par une mé- thode ﬂuorimétrique a conduit au développement récent des techniques de PCR quantitative en temps réel [6]. Ces dernières reposent, non plus sur une détection en point ﬁnal des produits de PCR formés, mais sur une analyse de la cinétique de la réaction PCR au moyen d’un système capa- ble de détecter « en tube fermé » les produits de PCR formés après chaque cycle d’ampliﬁcation. Principe de la PCR quantitative en temps réel Les bases mathématiques de la réaction PCR : rappels Nature exponentielle de la réaction PCR La PCR est par déﬁnition une réaction en chaîne au cours de laquelle les produits issus d’un cycle d’ampliﬁcation ser- vent de matrice pour le cycle suivant. Ainsi, la réaction en chaîne qui s’établit par la répétition des cycles de dénaturation-hybridation-élongation aboutit à une accumu- lation exponentielle théorique de 2n fois par molécule d’ADN. Autrement dit, la quantité de produits de PCR double à chaque cycle d’ampliﬁcation suivant la relation mathématique suivante : N = N0. 2n (où : N est le nombre de molécules ampliﬁées au ﬁnal, N0 le nombre initial de molécules et n le nombre de cycles d’ampliﬁcation). Efficacité d’ampliﬁcation Au niveau expérimental, la quantité de produit formé dé- pend d’un facteur primordial qui est l’efﬁcacité d’ampliﬁ- cation (E) déﬁnie comme étant la proportion moyenne des molécules d’ADN cible se dupliquant à chaque cycle d’ampliﬁcation. L’efﬁcacité d’ampliﬁcation est comprise entre 0 (aucune ampliﬁcation ne s’est produite) et 1 (après chaque cycle PCR, chaque molécule d’ADN cible a généré deux amplicons). Dans les conditions expérimentales habi- tuelles, E est inférieure à 1 et varie entre 0,78 et 0,97 selon le gène ampliﬁé [7]. L’introduction de ce facteur essentiel, qu’est l’efﬁcacité d’ampliﬁcation, dans le calcul du nombre de molécules ampliﬁées après n cycles d’ampliﬁcation conduit à l’équation suivante : N = N0.(1 + E) n Convertie sous forme logarithmique, cette équation a pour expression : Log N = Log N0 + n. Log (1 + E) revue générale Ann Biol Clin, vol. 61, n° 3, mai-juin 2003 280 La représentation graphique des variations du logarithme du nombre N de molécules ampliﬁées (Log N) en fonction du nombre de cycles d’ampliﬁcation (n) est une droite dont la pente est Log (1 + E) et l’ordonnée à l’origine le nombre initial de molécules (N0). Il est alors possible de calculer E : E = 10 – 1/pente puis d’en déduire le nombre initial de molécules N0. De nombreux facteurs expérimentaux (concentrations en dé- soxy nucléoside triphosphate (dNTP), en MgCl2 et enADN polymérase, température, structure secondaire et contenu en bases G/C de la séquence cible, longueur du fragment à ampliﬁer, présence d’inhibiteurs de l’ADN polymérase ou de la transcriptase inverse) peuvent affecter l’efﬁcacité d’ampliﬁcation. Phase plateau de la réaction PCR L’accumulation exponentielle de la quantité de produits au cours de uploads/Marketing/ biologia-molecular-qpcr-frances-pdf.pdf