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THÈSE présentée devant L’UNIVERSITÉ DE RENNES 1 Ecole Nationale Supérieure de C

THÈSE présentée devant L’UNIVERSITÉ DE RENNES 1 Ecole Nationale Supérieure de Chimie de Rennes (ENSCR) pour obtenir le grade de : DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE RENNES 1 Mention : « Chimie » par Anne-Cécile PETIT Ingénieur ENSCR UMR CNRS 6052 Synthèses et Activations de Biomolécules ENSCR Laboratoire Biotechnologies et Molécules Marines de l’IFREMER (Nantes) Ecole doctorale Sciences de la Matière Ecole Nationale Supérieure de Chimie de Rennes MODIFICATIONS D’UN EXOPOLYSACCHARIDE BIOSYNTHÉTISÉ PAR UNE BACTÉRIE ISSUE DES ÉCOSYSTÈMES HYDROTHERMAUX PROFONDS Soutenue le 16 décembre 2005 devant la Commission d’Examen M. H. PATIN Professeur à l’ENSC de Rennes UMR CNRS 6052 Président du Jury Mme J. COURTOIS Professeur à l’Université d’Amiens CNRS-FRE 2779 Rapporteur M. A. THIBODEAU Directeur des Affaires Scientifiques ATRIUM Biotechnologies, Québec Rapporteur M. N. GONDREXON Professeur à l’Université de Grenoble 1 UMR 5631 Examinateur M. N. NOIRET Chargé de Recherches CNRS à l’ENSC de Rennes UMR CNRS 6052 Directeur de Thèse Mme S. COLLIEC-JOUAULT Cadre de Recherches IFREMER, Nantes Codirectrice de Thèse M. J.P. HURVOIS Maître de Conférences à l’Université de Rennes 1 UMR CNRS 6509 Membre invité N° d’Ordre : 3295 A Gabrielle, mon arrière-grand-mère A Marc, mon grand-père A ceux que j’aime et qui m’aiment… AVANT-PROPOS Ce travail de thèse a été réalisé dans le Laboratoire Synthèses et Activations de Biomolécules, associé au CNRS (UMR 6052) de l’Ecole Nationale Supérieure de Chimie de Rennes (ENSCR) en collaboration étroite avec le Laboratoire Biotechnologies et Molécules Marines de l’Ifremer. Madame le Professeur J. Courtois, de l’Université d’Amiens, et Monsieur A. Thibodeau, Directeur des affaires scientifiques d’ATRIUM Biotechnologies, ont accepté d’être les rapporteurs de cette commission d’examen. Qu’ils en soient vivement remerciés. Je tiens également à remercier Monsieur H. Patin, Professeur à l’ENSC de Rennes, Monsieur J.P. Hurvois, Maître de Conférences à l’Université de Rennes 1, et Monsieur le Professeur N. Gondrexon, de l’Université de Grenoble 1, qui ont bien voulu juger ce travail. Je suis reconnaissante à la société ATRIUM Biotechnologies pour la confiance qui m’a été accordée en permettant la poursuite de ces travaux après le rachat de la société Lanatech. Je suis infiniment reconnaissante à Monsieur N. Noiret, Chargé de Recherches CNRS à l’ENSCR, qui, pendant 3 ans, par sa disponibilité, sa bonne humeur et son soutien, m’a aidée à surmonter les difficultés rencontrées en assurant le suivi au quotidien de ces recherches et la rédaction de ce mémoire. J’adresse également mes plus vifs remerciements à Madame S. Colliec-Jouault, Cadre de Recherches à l’Ifremer et codirectrice de cette thèse, pour sa disponibilité, son intérêt constant pour ce travail et son implication avisée dans la correction de ce mémoire. Je remercie tous les ingénieurs, chercheurs, techniciens et secrétaires des laboratoires de l’ENSCR et de l’Ifremer. Sans leur bienveillance, ni leur compétence et leur aide, ce travail n’aurait pu être mené à bien. Je tiens plus particulièrement à exprimer ma reconnaissance à Monsieur J.P. Guégan de l’ENSCR pour sa contribution importante à la partie RMN de cette thèse. Je tiens également à remercier Mesdames J. Ratiskol et C. Sinquin du centre Ifremer de Nantes dont les compétences ont souvent été mises à contribution. Cette thèse a fait l’objet de plusieurs collaborations. Ainsi, je tiens à remercier vivement Monsieur N. Gondrexon pour nous avoir permis de réaliser un premier changement d’échelle de nos manipulations. Je remercie également Monsieur J.P. Hurvois pour les travaux de dépolymérisation par électrolyse réalisés au sein de son laboratoire. Mes remerciements vont également à Monsieur A. Bondon chercheur dans l'UMR CNRS 6026 de l’Université de Rennes 1 pour la réalisation de spectres HRMAS et à Madame C. Rondeau, chercheur de la plate-forme RIO BIBS de l’INRA de Nantes pour l’enregistrement de spectres CPMAS. Ces recherches ont également bénéficié des efforts de plusieurs étudiants (N. Völkel, S. Röper et G. Hersant) dans le cadre de stages de recherches et je voudrais leur adresser mes remerciements. Je ne saurai oublier les bons moments passés avec mes voisins de paillasses et de bureaux : Bastien, Cécile, Céline, Fabien, Fabrice, Gérald, Gildas, Hervé, Holisoa, Isabelle, Karine, Marina, Mathieu, Myriam, Nicolas, Ronan, Sandrine, Vincent… merci à tous ! Je terminerai en remerciant les personnes qui, en dehors du contexte du travail, m’ont permis de mener à bien cette thèse. L’aboutissement de ces années d’étude n’aurait pu se faire sans l’aide d’Isabelle, ma Maman, de Thérèse, ma grand-mère, de ma sœur, Angèle, de mon Ami, Christophe, de Mylène et de tant d’autres… Un énorme merci à vous tous pour votre soutien sans faille. Au cours de ce travail, les techniques suivantes ont été utilisées : Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) - Les spectres RMN 1H ont été enregistrés sur le spectromètre à transformée de Fourier BRUKER ARX 400 de l’Ecole Nationale Supérieure de Chimie de Rennes (ENSCR). Les spectres RMN 1H ont été obtenus à 400,13 MHz. - Des expériences en HR-MAS avec un spectromètres RMN Avance 500 MHz (BRUKER) équipé d’une sonde HR-MAS triple résonance ont été réalisées au laboratoire « RMN structurale des protéines et des interactions lipides-protéines » de l'UMR CNRS 6026 (Université de Rennes 1). - Des expériences CP-MAS et SPE-MAS avec un spectromètre RMN WB AMX 400 MHz équipé d’une sonde 4 mm à double résonance H/X, à la température de 294 K et avec une fréquence de rotation de 7kHz, ont été réalisées au Centre de Recherches de l’INRA de Nantes. Les déplacements chimiques () sont exprimés en partie par million (ppm) par rapport au tétraméthylsilane (TMS) utilisé comme référence interne. Infrarouges (IR) Les spectres infra-rouge ont été enregistrés sur un spectromètre à transformée de Fourier THERMO NICOLET AVATAR 320 (ENSCR). Les échantillons ont été examinés sous forme de pastille dans le KBr (2 mg de produit dans 200 mg de KBr). Les fréquences d’absorption sont exprimées en cm-1. Analyses élémentaires - Les analyses élémentaires des éléments C, H, N et S ont été effectuées par le service de micro analyses du Centre Régional de Mesures Physiques de l’Ouest (CRMPO, Université de Rennes 1). - Les dosages des métaux (Cu, Zn et Mn) et du phosphore ont été réalisés au Service Central d’Analyses de Vernaison (CNRS). Lyophilisation Les solutions ont été lyophilisées avec un appareil CHRIST Alpha 1-2 (ENSCR) Ultrasonication - Les essais à l’échelle du laboratoire ont été réalisés sur un sonificateur VCX 600 basse fréquence de 20 khz commandé par un microprocesseur Vibra Cell 72412 (Bioblock Scientific) à l’ENSCR. - Les essais à une échelle petit pilote ont été réalisés sur des installations « maison » au Laboratoire d'Electrochimie et de Physico-chimie des Matériaux et des Interfaces (UMR 5631 / CNRS - INPG - UJF / Equipe de Génie des Procédés, Saint Martin d'Hères). Centrifugation Les solutions ont été centrifugées à l’aide d’un appareil HETTICH ZENTRIFUGEN – UNIVERSAL 32 R (ENSCR). Viscosimétrie Les mesures de viscosité ont été réalisées sur un viscosimètre rotatif Viscotester GL/R HAAKE (ENSCR). Ultrafiltration Une cellule à agitation Amicon type 8200 munie de membranes frontales, d’acétate de cellulose, de seuils de coupures de 500 Da (YCO5) a permis l’ultrafiltration d’échantillons (ENSCR). Chromatographie en phase gazeuse (CPG) Les analyses CPG ont été réalisées à l’Ifremer (centre de Nantes) sur un chromatographe 5890 série II (Hewlett Packard) avec passeur automatique équipé d’un détecteur à ionisation de flamme, d’une colonne apolaire en silice fondue CP-Sil5CB (Chrompack) et relié à un intégrateur HP 3365 (Hewlett Packard). Le gaz vecteur utilisé est l’hélium. Spectroscopie UV Visible Les analyses UV Visible ont été réalisées sur un spectrophotomètre UV-VIS-NIR Varian de référence Cary 4000 (ENSCR). Mesures de taille Les mesures de taille des particules ont été réalisées sur un appareil Zêtasizer 3000 HS de marque Malvern (ENSCR). Purification des solvants Les solvants ont été purifiés et séchés selon les procédures usuelles (D.D. Perrin, W.L.F. Armarego, Purification of Laboratory Chemicals 3ème éd., Pergamon Press, Oxford, 1988). Chromatographies sur silice Les chromatographies analytiques sur couches minces (CCM) inverses ont été réalisées sur des plaques de gel de silice C18 d’épaisseur 0,25 mm de référence RP-18W/UV254 (Macherey-Nagel). Polarographie sur mercure Les analyses par polarographie sur mercure ont été réalisées avec un polarographe Metrohm 626 avec mesure continue du courant (UMR CNRS 6509 « Organométalliques et catalyse, Chimie et Electrochimie Moléculaires » de Rennes). Montage électrolytique Afin de suivre la quantité de courant passant dans le système électrolytique, un intégrateur de type IG 5-N a été monté en série entre l’électrode de graphite (contre électrode) et le potentiostat (EG&G, 362) (UMR CNRS 6509 « Organométalliques et catalyse, Chimie et Electrochimie Moléculaires » de Rennes). La description des appareillages utilisés pour la détermination des masses molaires par HPSEC (High Pressure Size Exclusion Chromatography) est traitée dans la partie expérimentale de la partie 1 de ce mémoire. LISTE DES ABREVIATIONS ADN acide désoxyribonucléique BF basses fréquences BSA albumine de sérum bovin CCM chromatographie sur couche mince CM catalyse métallique CPG chromatographie en phase gazeuse CPM coups par minute CPMAS RMN du solide par polarisation croisée avec rotation à l’angle magique Da dalton DA degré d’acétylation DCC dicyclohexylcarbodiimide D dextrogyre DMAP N,N 4-diméthylaminopyridine DMEM milieu Eagle modifié par Dubelco DMF N,N diméthylformamide DMSO diméthylsulfoxyde DO uploads/Science et Technologie/ these-1232.pdf