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Hôpital Central de l’Armée Service de Microbiologie ÉTUDE CYTOBACTÉRIOLOGIQUE D

Hôpital Central de l’Armée Service de Microbiologie ÉTUDE CYTOBACTÉRIOLOGIQUE DU LIQUIDE CÉPHALORACHIDIEN LCR Pr 20 R 0 Rédigée le : 26 / 01 /2008 Par : Dr. DAOUDI Responsable du poste. Validée le 26 / 01 /2008 Par : Dr. TIOUIT Chef d’Unité de Bactériologie Nombre de pages 07 Le diagnostic d’une méningite est une urgence médicale. I/ PRÉLÈVEMENT : Le prélèvement du LCR est effectué dans les conditions rigoureuses d’asepsie soit par :  Ponction Lombaire.  Ponction sous occipitale.  Directement dans les ventricules. Ponction sous-occipitale et Ponction intra ventriculaire sont du ressort du neurochirurgien. 1. Ponction Lombaire : Ponctionner le cul de sac dural :  Lavage rigoureux des mains du médecin.  Le malade assis fortement penché en avant ou placé en décubitus latéral, le dos rond.  Tracer une ligne joignant les crêtes iliaques.  Repérer les apophyses épineuses L4 L5 et S1.  Désinfecter le site de ponction à l’alcool iodé 1 à 2٪ du centre vers la périphérie.  Introduire l’aiguille à PL munie du mandrin dans un plan strictement médian, avec une direction sagittale oblique de 25° à 30° vers le haut.  On sent la résistance du ligament inter épineux, puis celle du dure mère.  Retirer alors le mandrin.  La mise en place correcte est confirmée par l’écoulement en gouttes du LCR. On prélève 2-5 ml de LCR dans 3 tubes stériles : - 1er tube pour l’étude de la Numération Cellulaire, Examen direct et les Antigènes solubles. - 2ème tube servira à l’ensemencement des milieux de culture. - 3ème tube servira pour la recherche de BK. II/TRANSPORT : Les prélèvements de LCR seront transportés rapidement au laboratoire puis à la paillasse. Les prélèvements de LCR doivent être immédiatement analysés. Le LCR prélevé peut être ensemencé dans le milieu de transport pour germes vivants (TGV). Fiche de renseignements : Un minimum de renseignements cliniques concernant le patient doit accompagner le Prélèvement de LCR :  NOM et Prénom  Age du patient.  Service d’hospitalisation  Contexte clinico épidémiologique.  Présomption Diagnostic.  Traitement antibiotique antérieur ou actuel.  Recherche spécifique d’une bactérie (Mycobacterium tuberculosis).  Nom du Médecin III/ ANALYSE : A) MATÉRIEL : 1. Appareillage :  Centrifugeuse  Réfrigérateur  Étuve à 35°C  Étuve à CO2  Jarre  Agitateur  Microscope optique 2. Verrerie et autre matériel :  Lames porte objet  Lamelles  Tubes secs  Portoirs de tubes  Pipettes Pasteur stériles  Verre à pied  Anse de platine  Gants 3. Réactifs et colorants : Oxydase, H2O2, …. colorants : Colorants de Gram . Colorants de MGG . Le Bleu de Méthylène. Réactifs de détection d’Antigènes solubles : (Pneumocoque, méningocoque A et B, Haemophilus groupe b, Streptocoque du groupe b, E coli K1). 4. Milieux de culture : Gélose au sang cuit GSC Gélose au sang cuit GSC + Supplément poly vitaminique (Poly vitex ou extrait globulaire) Gélose au sang frais GSF Gélose au sang frais GSF préparée extemporanément si recherche d’anaérobies. Gélose nutritive GN Bouillon BHIB B) Technique : 1 er jour 1) Examen macroscopique :  LCR normal : Liquide clair, limpide, qualifié ‹eau de roche›.  LCR pathologique : divers aspects Trouble : provoqué par une hyper leucocytose. - Tous les degrés existent depuis la légère turbidité jusqu’à l’aspect ‹eau de riz›. Hémorragique : Il s’agit soit : * d’un accident lors du prélèvement (blessure vasculaire). soit * d’une hémorragie méningée.  Recueil du LCR dans 3 tubes successifs : * Hémorragie méningée : aspect du LCR est le même dans les 3 tubes. Le liquide ne coagule pas. * Blessure vasculaire : Le LCR se coagule spontanément. Xanthochromique : LCR teinté de jaune citrin.  Mentionner l’aspect macroscopique du LCR sur la fiche de réponse. 2) Mise en culture : 2.1/ Mise en culture systématique : - Homogénéiser le prélèvement de LCR. - Les ensemencements du LCR non centrifugé au niveau du laboratoire seront faits richement (3 gouttes au moins de LCR) sur des milieux permettant la croissance des bactéries exigeantes Responsables de méningites purulentes :  Gélose au sang cuit (GSC)  GSC + facteurs de croissance  Gélose au sang frais 5٪ sang de mouton (GSF)  Gélose nutritive (GN)  Bouillon BHIB - Les boites ensemencées seront incubées à 35-37°C sous atmosphère de 5-10 % de CO2 pendant 48 heures. - La GN et le BHIB ensemencés seront incubés à 35°C pendant 48 heures. 2.2/ Mise en culture au lit du malade : o Lors du recueil du prélèvement par ponction lombaire : o Laisser tomber 5 gouttes de LCR dans un tube de gélose au sang cuit inclinée. 3) Examen microscopique : 3.1) La Numération des éléments en cellule de Malassez ou Nageotte : L’examen microscopique effectué sur : - LCR complet. - Culot de centrifugation. La numération s’effectue après agitation douce du LCR complet, non centrifugé : - Dénombrement de tous les éléments nucléés/ mm3 du liquide (PN altérées ou non Altérées, lymphocytes) à l’aide d’un Hématimètre (cellule Nageotte ou cellule Malassez) : Adulte : LCR normal contient < 02 éléments cellulaires /mm3 Nouveau Né : LCR normal contient entre 10 – 30 éléments /mm3 (50 % Polynucléaires) - Dénombrer des hématies : Si le liquide est hémorragique, faire une dilution du LCR dans du sérum physiologique et calculer le rapport hématies / leucocyte :  >1000 : Rapport sanguin  < 1000 : processus infectieux NB : L’addition d’une goutte de solution alcoolique saturée de Bleu de Méthylène facilite la différentiation entre Hématies et cellules nucléées par coloration du noyau des cellules. Méthode d’utilisation de l’hématimètre : - Le LCR à analyser doit être fluide - Si le LCR serait « épais» (pus), le prélèvement doit être dilué dans de l’eau physiologique stérile pour pouvoir énumérer les éléments cellulaires. - La numération finale sera donnée en tenant compte de la dilution (1/10, 1/20, 1/40, …) - Agiter le LCR à analyser (remettre en suspension les éléments cellulaires) - Déposer une goutte sur l’hématimètre - Déposer la lamelle couvre objet sur les 2 plateaux latéraux de l’hématimètre. - Lecture se fait au microscope optique au grossissement 40. 3.2) Réalisation de la formule leucocytaire et de la coloration de Gram : La formule Leucocytaire : Elle est effectuée : - après centrifugation du LCR en tube conique stérile (pendant 10 min) - avec coloration au bleu de méthylène : pour différencier entre le PN et les lymphocytes - ou mieux avec coloration de MGG : pour l’équilibre leucocytaire - Si <1 élément / mm3 : ne faire ni MGG, ni Gram - De 1 à 10 éléments / mm3 et si syndrome méningé précisé sur la feuille de demande : faire un Gram sur culot de centrifugation du LCR - Si >10 éléments : faire systématiquement 2 lames de coloration du culot de centrifugation du LCR, une pour le bleu de méthylène ou MGG et une pour la coloration de Gram. Nbre d’éléments / mm3 < 1 élément 1 à 10 éléments >10 éléments Syndrome méningé non oui Gram à partir du culot de centrifugation - - + + MGG ou Bleu de Méthylène - - - + 4) Recherche d’antigènes solubles : Test Rapide La recherche des antigènes solubles est effectuée pour :  Numération cellulaire positive  Méningite décapitée  Germes fragiles - la recherche d’Antigènes solubles concerne les germes suivants :  Neisseria meningetidis  Streptococcus pneumoniae  Haemophilus influenzae  Streptocoque du groupe B  Escherichia coli K1 NB : Cette recherche est rarement positive en cas d’examen microscopique négatif. 5) Recherches particulières :  Recherche de Mycobacterium tuberculosis : - Un important volume (4-8 gouttes) de LCR non centrifugé doit être ensemencé sur pente de 2 tubes de Lowenstein Jensen (LJ) - Les cultures seront incubées pendant 42 à 72 jours à 35°C.  Recherche de bactéries anaérobies : Ensemencement de 2 boites de GSF (préparées extemporanément) : - L’une incubée à 35°C pendant 48 heures en anaérobiose - La deuxième incubée à 35°C pendant 5 jours en anaérobiose  Recherche de Listeria: - ensemencement d’une boite au sang frais (sang de mouton, cheval ou lapin) - les cultures seront incubées à 35° pendant 18 à 24 heures en aérobiose.  Recherche de Leptospires : Ensemencement de 10 gouttes de LCR dans 2 tubes de milieux liquides : - Milieu de Stuart enrichi en sang de lapin - Milieu pour culture des Leptospires Les cultures seront maintenues à 28-35°C pendant 1 mois à l’obscurité. 2 ème jour : Lecture des boites de cultures et identification : Les tests d’orientation : - aspect des colonies - Gram - Oxydase catalase - Hémolyse Pour le milieu BHIB : Les tests d’orientation : Trouble du milieu - État frai - Coloration de Gram Réisolement sur milieux adéquats Les tests de confirmations : - une galerie biochimique ou galerie API sont réalisée en fonction des paramétres d’orientation L’Antibiogramme : Doit être effectué pour chaque bactérie isolée à partir de la uploads/Sante/ 20-lcr.pdf