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Rapport de Stage au Service de Bactériologie de L'Hôpital Les Travaux de stage

Rapport de Stage au Service de Bactériologie de L'Hôpital Les Travaux de stage en 3ième année d'études vétérinaires portent sur l'approfondissement des connaissances sur un module de poids lourd; c'est la microbiologie, faisant appel à plusieurs branches médicales : Bactériologie, Immunologie, Parasitologie, à l'Hôpital régional de - où a été effectué mon stage- il était prévu qu'on aborde de façon pratique la bactériologie médicale et ses méthodes diagnostiques pendant 2 semaines. Pendant cette période, l'équipe du labo va me familiariser avec plusieurs notions importantes : Analyses bactériologiques de prélèvements divers, antibiogramme Table des matières Introduction............................................................................................................................................2 I. Présentation de l’Institut National de la Recherche Vétérinaire.........................................................3 І.1- Historique.....................................................................................................................................3 І.2- Localisation géographique.......................................................................................................3 І.3 Missions et activités de recherche.................................................................................................4 III-Le laboratoire de bactériologie:.......................................................................................................13 III-1-Confirmation sérologique de l’identification de la bactérie......................................................13 III-2-Réalisation d’un antibiogramme :.............................................................................................17 III-3- Culture des mycobactéries :.....................................................................................................21 Conclusion............................................................................................................................................26 I. Service de Bactériologie Médicale Présentation le service de bactériologie se compose d'une seule salle ou sont réalisés plusieurs tests diagnostiques Matériels utilisé: Une étuve : C’est un appareil de chauffage permettant de maintenir une température de 37°C 1 réfrigérateurs 1 bouteille à gaz 1 becs bunsen Les différents milieux de géloses utilisés : Les géloses et les autres milieux de galerie biochimique sont préparés dans une salle voisine il y en a plusieurs types Gélose ordinaire Gélose au sang Gélose au chocolat Gélose Chapman Gélose SS = gélose Salmonella- Shigella Le laboratoire de bactériologie: L’endroit où se déroulent les différentes étapes de la recherche bactériologique pour les salmonelles, qui est considéré comme un contrôle officiel selon la norme ISO 6579. Cette recherche se déroule sur différentes étapes que n’arrive pas a assisté à tous par manque de temps mais je vais bien détailler les étapes que je l’ai bien assimiler III-1-Confirmation sérologique de l’identification de la bactérie Appelée aussi sérotypage, la confirmation sérologique consiste en la réalisation de la galerie API 20 E. Cette galerie comporte 20 micros tubes contenant des substrats déshydratés dans lesquels des réactions se produisent, pendant la période d’incubation, et qui se traduisent par des virages colorés spontanés ou révélés par l’addition de réactifs . Le mode opératoire de la galerie API 20E est comme suit : - Préparation de l’inoculum: Pour ceci on prélève de la pente du milieu Kligler-Hajna une colonie et on réalise une suspension bactérienne en homogénéisant soigneusement les bactéries dans de l’eau physiologique . -Préparation de la galerie: On réunit fond et couvercle d’une boite d’inoculation et on reparti 5 ml d’eau distillée dans les alvéoles pour créer une atmosphère humide. Cette étape sert à réhydrater la galerie . - Inoculation de la galerie: Elle est variable selon les tests et se présente comme suit: Pour les tests Citrate (CIT), gélatinase (GEL) et VP, on rempli tubes et cupules des tests avec une suspension bactérienne en utilisant la pipette pasteur ayant servi pour le prélèvement. Remplir uniquement les tubes, et non les cupules, des autres tests. Créer une anaérobiose dans les tests Arginine dihydrolase (ADH), Lysine décarboxylase (LDC), Ornithine Décarboxylase (ODC), Production de H2S et Uréase (URE) en remplissant leurs cupules d’huile de paraffine. Après avoir terminé l’inoculation, on referme la boite d’incubation et on incube à 37°C pendant 24h. - Lecture de la galerie: La lecture de ces résultats se fait à l’aide du tableau de lecture sous-mentionné. Tableau de lecture de la galerie API 20E Tests Réactions / enzymes Résultats négatif s Résultats positifs ONPG Beta galactosidase Incolore jaune ADH Arginine di hydrolase Jaune Rouge/orangé LDC Lysine décarboxylase Jaune Rouge/orangé ODC Ornithine Décarboxylase Jaune Rouge/orangé CIT Utilisation du citrate Vert pale/jaune Bleu vert/ bleu H2S Production de H2S Incolore/ grisâtre Dépôt noir URE Uréase Jaune Rouge/orangé TDA Tryptophane Désaminase. On ajoute une goutte de réactif TDA immédiat Jaune Marron – rougeâtre IND Production d indole. On ajoute une goutte de réactif JAMES immédiat Incolore/vert pale/jaune Rose VP Production d acétone. On ajoute une goutte de réactif VP1 et VP2. Attendre 10 mn Incolore Rose/rouge GEL Gélatinase Non diffusion Diffusion du pigment noir GLU Fermentation/oxydation Bleu/bleu vert Jaune/jaune gris MAN Fermentation / oxydation Bleu/bleu vert Jaune INO Fermentation / oxydation Bleu/bleu vert Jaune SOR Fermentation / oxydation Bleu/bleu vert Jaune RHA Fermentation / oxydation Bleu/bleu vert Jaune SAC Fermentation / oxydation Bleu/bleu vert Jaune MEL Fermentation / oxydation Bleu/bleu vert Jaune AMY Fermentation / oxydation Bleu/bleu vert Jaune ARA Fermentation / oxydation Bleu/bleu vert Jaune Si trois tests ou plus sont positifs, on note sur la fiche de résultats touts les résultats obtenus. Par contre, si le nombre de tests positifs, dans lesquels on a ajouté les réactifs, est inferieur a 3 on réincube la galerie 24h de plus sans ajouter de réactifs - Interprétation des résultats : L’identification est faite à partir du catalogue analytique ou d’un logiciel d’identification (profil numérique). On détermine le profil numérique en additionnant les valeurs indiquées au dessous de chaque test, les tests sont séparés par groupe de trois. On obtient alors un code formé de 7 chiffres A partir de ce code, on cherche le profil adéquat dans la base de données du catalogue analytique. On obtiendra par exmple comme résultat: Salmonella spp si le code de la galerie API correspond à celui de Salmonella spp dans le catalogue. Dans le cas ou on veut réaliser un sérotypage, on doit envoyer le prélèvement a l’Institut Pasteur de Tunis. Durant toutes les étapes du travail d’analyse, on doit consigner les résultats obtenus dans une fiche. Les étapes de recherche bactériologiques les prélèvements les échantillons sont prélevés avec des instruments stériles dans un récipient stérile. Chaque prélèvement est accompagné d’une fiche de renseignements concernant le patient. Le matériel a-Les tubes à visser Il existe des pots stériles à bouchon à visser pour l’ensemble des prélèvements y compris les urines, les selles... b-Les tubes sous vide Les tubes sous vide sont essentiellement utilisés pour les prélèvements de sang, de liquides pleuraux c-les seringues utilisées pour une ponction de pus d’abcès et/ou d’une collection de liquide d- les écouvillons Les différents prélèvements 1- L’urine L’urine sera recueillie dans des facons stériles, Un prélèvement d’urines est à acheminer dans les plus brefs délais ou à réfrigérer. 2- Le sang Le sang devrait être prélevé dans des tubes à EDTA (éventuellement au citrate) et envoyé rapidement au laboratoire. Cependant, la meilleure technique consiste à acheter des flacons spéciaux pour hémocultures. 3- Les pus Tout prélévement de pus sera fait dans un pot stérile ou à la seringue. Alternativement, un écouvillon de pus pourra être envoyé au laboratoire. Cependant, dans ce dernier cas, il faut veiller à ce qu’une quantité suffisante de matériel soit prélevée. 4- Les crachats les crachats seront également prélevés dans des pots stériles. Pour les jetages, un moyen facile et usuel est l’écouvillon. 5- Les matières fécales En ce qui concerne les matières fécales, on les prélève dans un pot hermétiques 6- Les poils, les prélèvements cutanés Les prélèvements cutanés secs et les poils seront effectués par grattage avec un instrument stérile et recueillis dans des pots stériles ou une boîte de Pétri stérile. Les prélèvements cutanés humides sont faits à l’écouvillon. 7- Le liquide céphalo-rachidien, les liquides pleuraux ou péritonéaux. Le LCR et les liquides internes, prélevés à la seringue seront ensuite transvasés stérilement dans des tubes étanches. observation au microscope la technique se fait en suivant ces étapes: Réaliser un frottis et le fixer. Recouvrir la lame de violet de gentiane phéniqué durant une minute. Toutes les bactéries prennent ce colorant et sont donc colorées en violet. Jeter l’excédent, rincer à l’eau du robinet et recouvrir la lame de réactif de Lugol Laisser agir 1 minute. Rejeter l’excédent et rincer à l’eau Recouvrir d’alcool pendant quelques secondes puis rincer à l’eau du robinet immédiatement Recouvrir de Fuschine diluée au 1/20ème pendant une minute Rincer à l’eau du robinet et sécher entre deux feuilles de papier absorbant. Observer à l’objectif 100 à immersion , à pleine lumière. La coloration de Giemsa D'abords Réaliser un frottis et le fixer Recouvrir de solution de Giemsa (diluée) et laisser colorer 30 minutes. On peut également utiliser une cuve à coloration. Eliminer le colorant et rincer à l’eau tamponnée. Rincer ensuite à l’eau du robinet. Sécher entre deux feuilles de papier absorbant et observer à l’objectif 100 à immersion. La coloration de Ziehl Technique Réaliser un frottis et le fixer. Ce frottis ne doit être ni trop fin, ni trop épais. Recouvrir complètement la lame de fuschine de Ziehl concentrée et chauffer la lame. Ce chauffage se fait à l’aide d’un bec Bunsen en faisant un mouvement de va et vient jusqu'à émission de vapeurs blanches. Eliminer le surplus de colorant, laisser refroidir un peu la lame et rincer à l’eau du robinet. Recouvrir la préparation d’une solution d’acide sulfurique au 1/4 (ou d’acide nitrique au 1/3) pendant 40 secondes à 1 minute. Rincer à l’eau du robinet Recouvrir de bleu de méthylène pendant 1 minute. Rincer à l’eau du robinet et sécher entre feuilles de papier absorbant. Observer à l’objectif 100 à l’immersion. Les bactéries acido-resistantes apparaissent roses, les autres apparaissent uploads/s3/ hopta322234712-1.pdf