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Faculté des Sciences de la Nature et la vie / Département de biotechnologie Nom

Faculté des Sciences de la Nature et la vie / Département de biotechnologie Nom : Boudjemai Prénom : Mohammed L3 Biologie Moléculaire DIFFÉRENCES entre les MICRO-ARN et Arni ET Comparaison des deux type d ampliphication de séquençage haut débit Plan de Travail A/DIFFÉRENCES entre les MICRO-ARN et Arni 1/ DIFFÉRENCES entre les MICRO-ARN et Arni 2/ Mécanisme d’action des siARN Arni médiée (exogène) 3/ Mécanisme d’action de miRNA véhiculée par Arni (endogène) B/Comparaison des deux type d ampliphication de séquençage haut débit 1/Comparaison entre la préparation des 2 Amplification a/La technologie 454 (Émulsion) b/La technologie Illumina/Solexa 2/Comparaison des deux type d ampliphication 1/DIFFÉRENCES entre les MICRO-ARN et Arni L’interférence d’ARN double brin dans la traduction est un mécanisme qui peut être médié par deux molécules distentas : miRNA (micro-ARN) et siRNA (petits ARN interférents, anglais). Les micro-ARN est des produits naturels de la transcription chez les eucaryotes beaucoup. Ils sont environ 70 nucléotides qui sont complémentaires entre eux, formant une pince. Le siARN dérivées de molécules d’ARN double-brin long d’origine exogène (comme celles de virus à ARN). La figure montre l’enzyme DICER briser cette cassette longtemps endogène, formant ainsi, petite siRNA A/Mécanisme d’action des siARN Arni médiée (exogène) Comme le montre la figure précédente, l’enzyme DICER coupe le ruban en petits fragments, avec 2 bases sur chaque bande, appelée, puis d’Arndb. Chaque groupe de vie a DICER différent. Chez les mammifères, un seul type de DICER, chez la drosophile, deux, par exemple. Les petits fragments d’Arndb sont ensuite chargés dans un complexe enzymatique formé par l’enzyme Argonauta et certaines autres enzymes, comme une hélicase et une enzyme dont le domaine linker dsRNA, appelé R2D2. Tout comme il est la forme complexe un Ribosome, traduction du RNA en protéines, là c’est complexe pour la traduction. L’un des sous-unités prend une des bandes et l’autre ARN. Il existe un mécanisme de l’instabilité dans la région 5 dsRNA ´, qui favorise la permanence de la cassette supplémentaire dans le complexe (c’est toujours à l’étude). La connexion entre le ruban et l’enzyme est Qu'argonauta du complexe est très forte. Cette association est alors appelée le RISC complexes. Maintenant il y aura un appariement entre le ruban à l’intérieur du complexe RISC et l’ARNm. Si l’appariement se produit dans son intégralité (sans partie de restes de l’ARNm sans paire), le complexe RISC dégrader l’ARNm. Si l’appariement se produit partiellement, l’ARNm est déstabilisé. Dans cette condition, l’ARNm déstabilisé peut être branchés aux soi-disant traitement corps (corps-P: citosólicas structures responsables de la dégradation de l’ARNm). Dans les deux cas, il n’y aura aucun traduction en protéine. N’oubliez pas ces bandes de siARN qui ont été ignorés par le complexe RISC. Ils devrait être dégradés par les enzymes de ribonucléases 3' -5 ' ou « -3' 5 RNAses selon le cas. Mais il peut y avoir une autre transformation : il peut être transformé en double brin par RNApolimerase ARN-dépendante. Ainsi, peut être disponible pour l’enzyme DICER, augmentant par ordre progressif. B/Mécanisme d’action de miRNA véhiculée par Arni (endogène) Le gène de miRNA formation conduit à la formation d’une protéine, ni a la configuration typique d’un gène, en plus d’être trop petit. Depuis plusieurs années, resta inconnue mécanisme d’interférence RNA. Quand un gène est transcrit, se traduit par une longue chaîne de séquences d’ARN qui sont complémentaires dans sa propre prison, lui faisant plier et sécurisé, formant un clip, ou pinces diverses, selon la quantité de répétitions de séquences qui sont complémentaires . L’enzyme DROSHA qui se trouve dans le noyau s’attache à ces clips, ce qui les rend indépendant de la chaîne de RNA qui a généré. Ces fragments seront transférés vers le cytoplasme où l’enzyme DICER commence le complexe semblable à celle rapportée avec le siARN 1/Comparaison entre la préparation des 2 Amplification a/La technologie 454 (Émulsion) • Fractionnement aléatoire de l’ADN de l’échantillon à analyser en morceaux de 300 à 800 pb pour obtenir une banque d’ADN simple brin matrice. • Préparation en ajoutant des adaptateurs spécifiques des extrémités 3' et 5’. • Immobilisation de chaque brin sur une bille. Un fragment d’ADN = une bille. • Émulsion des billes avec les produits d’amplification dans un mélange eau-huile. Création de microréacteurs contenant une seule bille. • PCR en émulsion. Amplification de chaque séquence dans son microréacteur. Amplification de toute la banque en parallèle. Plusieurs millions de copies par bille. • Purification et chargement des fragments sur plaque. Le diamètre des puits ne permet qu’une seule bille à la fois. • Ajout des enzymes de séquençage et envoi des nucléotides individuels les uns après les autres. • Les bases complémentaires du brin matrice s’ajoutent une ou plusieurs à la fois. • Le signal chimie luminescent est enregistré par une caméra CCD. • Séquençage par synthèse avec émission de lumière, on parle de pyroséquençage La lecture est effectuée en simultanée sur plusieurs bases incorporées. Le « flowgram » est alors lu pour obtenir la séquence. • On obtient : - 400 000 lectures ; - chacune de 250 bases ; - 100 Mb par run. • Les erreurs majeures de séquences proviennent avec cette méthode des homopolymères. b/La technologie Illumina/Solexa • Génération d’une banque d’ADN double brin à partir de l’échantillon à analyser par fractionnement aléatoire en morceaux de 200 pb. • Ajout d’adaptateurs spécifiques aux extrémités. • Dénaturation de l’ADN en simple brin. • Fixation de l’extrémité des simples brins aléatoirement à la surface du « flowcell ». • PCR « bridge » en phase solide. Création d’un double brin. Dénaturation et création de groupes (clusters) denses où les fragments sont amplifiés. • Le premier cycle de séquençage commence en ajoutant les 4 terminateurs réversibles marqués, les amorces et l’ADN polymérase. • Après excitation par un laser, la fluorescence émise par chaque cluster est récupérée et la première base est lue. • Le cycle suivant continue en ajoutant les 4 terminateurs réversibles marqués. • Après excitation l’image est acquise de la même façon et la deuxième base est lue. • Les cycles de séquences sont répétés pour lire chaque base les unes après les autres. • La lecture est effectuée à chaque position sur toutes les séquences en parallèle. • On obtient : - 45 000 000 de lectures ; - chacune de 36 bases ; - 1 Gb par run. • Les erreurs majeures de séquences proviennent d’erreur de séquençage (99%) 2/Comparaison des deux type d ampliphication La technologie 454 (Émulsion) La technologie Illumina chemistry Pyrosequencing standard Reversible terminators Fragment Run time 7 hours 3 days Read lengths(pb) 250 35,50 Ave.Reads per Run 400k 85*1000000 Date per Run 100MB Up to 4,3 GB Troughtput 100 MB 1,4 GB/Day Passer à la langue suivante : anglaisChromas est un visualiseur de traces gratuit destiné aux projets simples de séquençage d’ADN ne nécessitant pas l’assemblage de séquences multiples. Chromas présente les caractéristiques suivantes: Ouvre les fichiers de chromatogramme .ab1 des séquenceurs d’ADN d’Applied Biosystems.Opens Les fichiers de chromatogramme de format SCF et ZTR créés par d’autres séquenceurs ou extraits de bases de données.Enregistrez au format .scf ou Applied Biosystems au format .ab1.Imprimez un chromatogramme avec des options permettant d’agrandir ou de zoomer sur une page. Suppression automatique des séquences de faible qualité (lorsque les données de qualité sont disponibles) ou des séquences de vecteurs.Exportez des séquences au format texte brut, FASTA, FASTQ, EMBL, GenBank ou GCG, ou formatées avec une numérotation de base pour la présentation.Copiez la séquence dans le presse-papier en texte brut, au format FASTA ou FASTQ pour le coller dans d’autres applications.Réversez et complétez la séquence et le chromatogramme.Recherchez les sous-séquences par correspondance exacte ou alignement optimal.Affichez les traductions dans 3 cadres avec la séquence.Copiez une image d’une section de chromatogramme pour coller dans des documents ou des présentations. Traitement par lots, y compris conversion de format, exportation de séquences avec suppression de vecteurs, impression et exportation en lots de données brutes. 1 fichiers utilisant le composant RP PeakTrace de Nucleics Pty Ltd pour améliorer la lisibilité des pics et extraire davantage de bases de haute qualité. Résultat Web avec des liens annexes Google Traduction https://translate.google.com › ... Ce service gratuit de Google traduit instantanément des mots, des expressions et des pages Web du français vers ... À propos uploads/Finance/ expose-2 1 .pdf