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TD microbiologie Techniques d’étude et d’identification microbiennes : Etude mi

TD microbiologie Techniques d’étude et d’identification microbiennes : Etude microscopique : L’examen microscopique débute par une préparation à l’état frais. 1/ Etat Frais :  Principe : Cet examen permet d’apprécier la forme et parfois la mobilité des germes étudiés. Il faut éviter de confondre la mobilité d’une bactérie avec les mouvements de convention susceptibles de l’entraîner.  Technique : Cette préparation consiste à examiner les microorganismes vivants entre lame et lamelle. Une goutte de suspension bactérienne est déposée au centre de la lame, puis déposer une lamelle au- dessous en évitant de créer les bulles d’air. L’observation se fait par microscope optique aux grossissements x 10 et x 40.  Lecture : Cet examen permet de savoir si on a affaire à une bactérie, à un champignon filamenteux ou à une levure. Dans le cas des levures et moisissures, l’examen permet une étude morphologique satisfaisante. L’étude morphologique des bactéries nécessite la préparation d’un frottis coloré selon la méthode de la coloration de Gram. 2/ Coloration de Gram :  But : Permet de diviser les bactéries en 2 groupes : Gram + (celles qui retiennent le violet de gentiane après le lavage à l’alcool), et Gram- (celles qui sont décolorées et prennent ensuite la couleur d’un second colorant).  Principe : Cette méthode est basée sur la différence de structure de la paroi chez les 2 groupes : forte proportion de lipides (20 %) chez les gram – et faible chez les Gram +. Le traitement par l’alcool extrait les lipides chez les Gram -, entraînant une augmentation de la perméabilité de la paroi et l’extraction du complexe iode/violet de gentiane : Ceci provoque la décoloration des organismes. Les parois des Gram + au contraire sont déshydratées par l’alcool : leur perméabilité diminue et le colorant ne peut être extrait.  Technique : Préparation du frotti : prélèvement par une pipette pasteur ou une anse de platine de quelques gouttes ou une parcelle de la colonie à étudier et la déposer sur une lame propre et l’étaler. Fixation : Pour tuer les germes, fixer leurs structures cytologiques sans altération et augmenter la perméabilité membranaire aux colorants. Elle peut se faire par la chaleur, l’alcool- ether ou l’acide osmique.  Coloration proprement dite : Quelques gouttes de solution aqueuse de violet de gentiane sont répandues sur le frotti puis l’excès du violet est jeté après une minute de contact. Ensuite le frotti est recouvert de lugol de Gram ; cette liqueur prend une teinte mordorée ; on la jette au bout de quelques secondes.  Décoloration : La lame est ensuite décolorée à l’alcool qui sera versé goutte à goutte jusqu’à ce qu’il n’est plus d’action décolorante.  Coloration de contraste : Après lavage à l’eau de robinet, le frotti est recoloré à la fushine de Ziehl au 1/10 pendant 1 mn puis lavé à l’eau, séché et examiné par microscope optique à l’immersion au grossissement x 100. Lecture : Les bactéries Gram + apparaissent en bleu noir et les Gram – en rouge. Etude biochimique et physiologique : 1/ Caractères culturaux : La culture en boite de pétri permet de différencier la forme et la couleur des colonies. 2/ Type énergétique et respiratoire : Etude du métabolisme oxydatif ou respiratoire : (Etude de la Voie d’Attaque des Glucides) :  But : Déterminer la voie empruntée par la bactérie pour dégrader le glucose. Le métabolisme fermentaire engendre la formation d’acides ou d’alcool alors que le métabolisme oxydatif n’en produit pas. L’épreuve de HUGH et LEIFSON permet de déterminer la voie empruntée en utilisant des géloses molles, faiblement peptonnées et présentées en culot (M.E.V.AG.).  Technique : - 2 tubes de milieu sont régénérés par chauffage aux bains-marie puis additionnés de glucose puis solidifiés. - L’ensemencement se fait par piqûre centrale : Un tube est incubé en aérobiose et l’autre en anaérobiose réalisé par dépôt d’une couche de paraffine stérile sur le milieu.  Lecture : Colorations M.E.V.A.G. + Vaseline M.E.V.A.G. sans vaseline Métabolisme emprunté Jaune Jaune Fementaire Jaune en surface Jaune en surface Fermentaire aérobie stricte Rouge Jaune Oxydatif Rouge rouge Inerte NB: L’indicateur de pH est le rouge de phénol. Mise en évidence d’une « respiration anaérobie » : Réduction des nitrates en nitrites :  Principe : Certaines bactéries anaérobies facultatives utilisent un métabolisme de type oxydatif sous des conditions d’anaérobies. Ce procédé est la respiration anaérobie. Les nitrates sont en principe toxiques pour la plupart des bactéries mais certaines peuvent les utiliser comme accepteur des é et l’azote moléculaire formé est relargué dans le milieu. Chez certaines espèces ce sont les nitrates qui sont successivement réduits en nitrites puis en azote. Ce procédé de dénitrification est retrouvé chez les Pseudomonas. NO3 + 2( H+, é ) Nitrate réductase NO2 -- + H2O . 2NO2 -- + 8 ( H+, é ) Nitrite réductase N2 + 4H2O . La présence est alors déterminée à l’aide des réactifs de GRIESS-ILOSWAY : Acide Sulfanilique & Alpha Napha-tylamine.  Technique : Au bouillon de Nitrate ensemencé, ajouter 4 gouttes du réactif 1 ( acide sulfanilique) puis 4 gouttes du réactif 2 (alpha-naphtylamine).  Lecture : - Si la coloration rose apparaît : la bactérie possède la Nitrate réductase. Soit les nitrates n’ont pas été réduits. - Si le milieu reste incolore : Ou bien ils ont été transformés en Nitrites puis en Azote. L’addition d’un réducteur comme la poudre de Zinc permet de différencier ces 2 voies : - Si le milieu devient rose : les Nitrates sont présents La bactérie ne possède pas la Nitrate réductase. - Si le milieu reste tel quel : Les nitrates ont été réduits en Nitrites puis en azote ammoniacal : La bactérie possède la Nitrate réductase. Mise en évidence des enzymes respiratoires : Recherche de l’oxydase :  But : Différencier chez les bacilles Gram - les Entérobactéries des pseudomonas.  Principe : Dans la chaîne respiratoire, le dernier cytochrome qui transfert les é à l’o 2 est appelé cytochrome oxydase ou aa3. Sa présence chez une bactérie ne peut être mis en évidence que si la cellule possède ainsi le cytochrome c. Ces 2 cytochrome ont la propriété d’oxyder le diméthyle ou le tétraméthyl paraphénylène diamine en une semi-quinone colorée en rouge. Cyt c +++ + Cyt aa3 +++ + Réactif réduit (incolore). Cyt c ++ + Cyt aa3 ++ +Réactif oxydé (rouge).  Technique : - Sur une lame propre, déposer un disque préalablement imprégné d’une goutte d’eau distillée stérile. - Prélever à l’aide d’une pipette Pasteur boutonnée une colonie à étudier et la déposer sur le disque.  Lecture : - La bactérie oxydase + : coloration rose au point du dépôt, qui vire au brun puis au noire : Bactéries aérobies strictes ou aérobies facultatives. - Les bactéries oxydase - : Ne change pas la couleur du réactif :Bactéries aérobies facultatives ou anaérobies. Recherche de la Catalase :  But : Différencier chez les Cocci Gram + les Staphylocoques des Streptocoques.  Principe : Lors de la déshydrogénation (oxydation du substrat), l’o2 moléculaire est réduit selon la formule : SH2 + O2 S H2O + ½ O2 H2O2 L’eau oxygénée qui se forme est très toxique pour les bactéries, et les bactéries aérobies possèdent des déshydrogénases oxytrophes qui détruisent l’ H2O2, soit par catalases ou par peroxydases selon la réaction : H2O2 H2O + ½ O2.  Technique : - Prélever une colonie et la déposer sur une lame propre, puis déposer sur cette colonie une goutte d’H2O2.  Lecture : - Dégagement des bulles gaz : La bactérie est Catalase +. Etude du métabolisme glucidique : Fermentation avec ou sans gaz, utilisation du Lactose et du Saccharose et production d’H2S :  Principe : Cette réaction est réalisée sur milieu T.S.I. (Tri-Sugar-Agar) : Ce milieu se présente en gélose inclinée contenant du glucose à 1 g/mille et 2 Diholosides à 10 g/mille et du rouge de phénol comme indicateur et un sel de fer. Dans un 1er temps : il y a fermentation du glucose ce qui permet à la bactérie de produire l’énergie nécessaire à la synthèse des enzymes spécifiques des diholosides, ce qui se traduit par une acidification du milieu qui vire au jaune au niveau du culot. Dans un 2eme temps : Les bactéries commencent à dégrader le les peptones contenus dans le milieu et les diholosides si elles en possèdent les enzymes. La dégradation libère les acides aminés qui alcalinisent le milieu, et la dégradation des diholosides libère les acides qui acidifient le milieu. L’équilibre entre ces deux réaction aboutit à : - Une alcalinisation si la bactérie est diholosides - : virage du milieu au rouge. - Une acidification si la bactérie est diholosides + : Virage au jaune. * La production du gaz : La plupart des fermentations bactériennes s’accompagnent de production de gaz, soit C O2 , soit H2 ou bien les 2. * Un noircissement dû à la formation du sulfure de fer traduit la production d’H2S, ce qui signifie uploads/Geographie/ td-techniques-detudes-et-identification-microbiennes.pdf