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Institut Supérieure de Biotechnologique de Sfax ISBS Etude cytobactériologique

Institut Supérieure de Biotechnologique de Sfax ISBS Etude cytobactériologique des urines I. But de la manipulation : Le but de notre manipulation est l’étude cytobactériologique des urines (ECBU). II. Principe de la manipulation : Le principe de notre manipulation est basé sur ; 1. Définition l’ECBU : L'examen cytobactériologique des urines est un examen de biologie médicale, étudiant l'urine d'un patient. Il est fréquemment utilisé pour diagnostiquer une infection urinaire. Les principales circonstances de demande d'un ECBU sont: la présence de signes cliniques cystite, pyélonéphrite, prostatite. une fièvre isolée surtout chez le nourrisson. une hématurie, une pyurie, des tests de dépistage positifs. une prescription systématique chez des patients à risque : diabétiques, grabataires, problèmes urologiques, porteurs de sonde, femmes enceintes, bilan préopératoire etc. un contrôle de traitement. 2. Déroulement de l’examen cytobactériologique des urines : L’ECBU regroupe différents examens : Un examen macroscopique : Un examen direct avec une analyse au microscope des cellules présentes dans les urines (examen cytologique). Un examen microscopique : Il comporte deux paramètres : l’examen à l’état frais et la coloration de Gram. Un examen bactériologique : Il est effectué avec une recherche de bactéries et d’agents mycosiques dans l’échantillon urinaire. Institut Supérieure de Biotechnologique de Sfax ISBS Un antibiogramme : Il permet d’analyser la sensibilité des éventuelles bactéries retrouvées dans les urines aux différents antibiotiques afin de prescrire un traitement adapté. a. Examen macroscopique : Couleur : Normale : jaune pâle, transparent, +/- foncé Une coloration rose ou rouge : il s’agit de l’hématurie Une coloration orangé- acajou : ictère (jaunisse) Aspect : Transparent limpide. Trouble indiquant la présence des leucocytes et des bactéries. PH : Mesure du pH grâce à l’électrode d’un pH-mètre Le pH urinaire est acide : donc inhibe la croissance bactérienne. Une variation du pH urinaire vers l’alcalisation : entraîne une multiplication bactérienne. b. Examen microscopique : Examen cytologique à l’état frais: L'examen en cellule de Malassez permet de dénombrer les éléments figurés contenus dans un volume donné de l'urine à étudier. Leur concentration est exprimée par millilitre (ml). Examen microscopique d’un frottis coloré au Gram : Institut Supérieure de Biotechnologique de Sfax ISBS Cet examen permet d'observer les microorganismes présents dans le sédiment urinaire. c. Examen bactériologique: i. L’isolement : Les bactéries responsables d’infections urinaires se développent sur les différents types de milieux de culture. La mise en culture permet l'isolement des bactéries sur des milieux sélectifs suivantes : Gélose PCA : C’est un milieu utilisé pour le dénombrement des microorganismes aérobies revivifiables. C'est un milieu nutritif sans inhibiteurs, dont l'intérêt est de favoriser le développement à 37 °C pendant 24h de tous les micro-organismes qu'on y a déposés. L'ensemble de tous les micro-organismes existants s'appelle la flore totale. Aspect de milieu avant l’utilisation Aspect de milieu après l’utilisation Le milieu SS (Salmonella-Shigella) : La gélose Salmonella-Shigella (S.S.) est utilisée pour l’isolement sélectif des Salmonella et des Shigella dans les prélèvements cliniques (selles) et les denrées alimentaires. Incubation à 37°C pendant 24h. La présence de ces colonies est transparente de centre noir. Aspect de milieu avant l’utilisation Aspect de milieu après l’utilisation Institut Supérieure de Biotechnologique de Sfax ISBS Le milieu king A : Le King A est un milieu de culture utilisé pour différencier les espèces du genre Pseudomonas, par la mise en évidence de la production de pigments spécifiques. Le milieu kligler : C’est un milieu de culture permettant l’isolement des entérobactéries. ii. Identification L'identification est orientée par l'examen des frottis colorés au Gram effectués à partir des différents types de colonies isolées, la recherche de la catalase pour les bactéries à Gram positif et d'une cytochrome-oxydase pour les bacilles à Gram négatif. L'identification est réalisée par l'étude des caractères biochimiques avec des milieux traditionnels ou des galeries commercialisées prêtes à l'emploi. d. Antibiogramme : Du fait de l'augmentation croissante des résistances acquises aux antibiotiques, l'antibiogramme doit être réalisé dans tous les cas d'infection urinaire ayant fait l'objet d'une prescription d'ECBU. La méthode de référence et la plus fréquente est la méthode par diffusion en milieu gélosé, reposant sur l'emploi de disques chargés d'antibiotiques. Elle doit être bien standardisée, l'épaisseur de la gélose, la densité de l'inoculum et la bonne conservation des disques étant les points les plus importants. Le milieu utilisé est : Milieu Muller Hinton qui permet d’étudier la sensibilité à des antibiotiques. III. Mode opératoire : 1. Préparation du sédiment urinaire : Institut Supérieure de Biotechnologique de Sfax ISBS On fait homogéniser l’urine et on centrifuge pendant 5 minutes à 2000 Tours /minutes On récupére le culot contenant les cellules urinaires On mettre en supension le culot (ajouter 3ml d’eau physiologique stérile) en aspirant et refoulant doucement trois fois avec une pipette. 2. Déroulement de l’examen cytobactériologiques des urines : a. L’examen macroscopique : On note la couleur On note l’aspect On mesure le PH à l’aide d’un pH-mètre : b. L’examen microscopique : *A l’état frais : À partir de sédiment urinaire, on étale à l’aide d’une pipette : Sur la cellule de Malassez. Entre lame et lamelle. *La préparation d’un frottis coloré au gram : À partir de sédiment urinaire on suit la technique de coloration de gram : On prépare le frottis séché à partir du sédiment urinaire. On dépose une solution de violet de gentiane ou cristal violet pendant 20 secondes Une solution de lugol pour fixer le premier colorant, pendant 20 secondes De l’alcool à 95° et de l’eau, alternativement, jusqu’à la décoloration complète des bactéries fixées Une solution de fushine basique ou de safranine de couleur rose, pendant 10 secondes Observer à l’objectif 100 à immersion, à pleine lumière. Institut Supérieure de Biotechnologique de Sfax ISBS c. La mise en culture : A partir de sédiment urinaire on ensemence sur les milieux suivants : PCA. Gélose King A. Gélose Khilger. Gélose S-S. On les incube à 37°C pendant 24h. d. La technique de l’antibiogramme : On effectue la technique de l’antibiogramme sur le milieu Muller Hinton comme suit : On ensemence la suspension bactérienne sur le milieu Muller-Hinton. On fait distribuer les disques d’antibiotiques (l’Ampicilline) à l’aide d’une pince en mettant certaines distances entre les disques. On incube à 37°C pendant 24h. IV. Résultats obtenus et leurs interprétations : 1. Examen macroscopique : Couleur : Jaune Aspect : transparent, non trouble PH : acide ; PH= 6,8 Institut Supérieure de Biotechnologique de Sfax ISBS Selon les résultats fournis par ce type d’examen, on peut constater qu’il s’agit des conditions normales de l’échantillon d’urine ce qui nous permet d’orienter le déroulement des résultats de l’ECBU. 2. Examen microscopique : a. Examen microscopique à l’état frais : Résultats obtenus : Entre lame et lamelle : On peut observer les éléments suivant : Des cellules épithéliales : Des cristaux Carbonate de calcium Urates ammoniacaux magnésiens Phosphate triple Institut Supérieure de Biotechnologique de Sfax ISBS Sulfate de calcium Oxalate de calcium Phosphate bi calcique Acide urique Sur la cellule de Malassez : En effet ,cette technique est préférable à l’examen de l’urine entre lame et lamelle qui conduit à un résultat rendu par champ microscopique, moins reproductible et plus difficile à interpréter, ainsi , on peut en plus d’observer les différentes types des éléments figurées dans le sédiment urinaire effectuer un comptage de nombres de leucocytes : Nombre de leucocytes/ml= 3*10 ³ * 20 = 6 .10⁴ Leucocytes/ml Interprétation des résultats de l’examen microscopique : Institut Supérieure de Biotechnologique de Sfax ISBS Le nombre de germes présents dans l'urine permet d'affirmer ou non l'existence de l'infection : S’il est inférieur à 1 000/millilitre : il n'y a pas d'infection. S’il est compris entre 1 000 et 100 000 : il y a peut-être une infection, sans certitude absolue. S’il est supérieur à 100 000 : on sait de façon certaine qu'il y a une infection. Dans notre cas le nombre de leucocytes obtenus indique une absence de l’infection d’où cet examen cytologique nous permet de confirmer les observations de l’examen macroscopique ainsi on peut déduire selon ce démarche des étapes de l’ECBU que notre échantillon d’urine est sain. b. Examen microscopique du frottis coloré au gram: Résultats obtenus : L’observation microscopique montre la dominance des bactéries Gram(-) de coloration rose. Interprétation : Normalement, plus de 90 % des germes présents dans l'urine sont Gram négatifs (ils ne fixent pas la coloration de Gram) : Escherichia coli, Proteus, Klebsiella, Enterobacter. Institut Supérieure de Biotechnologique de Sfax ISBS 3. Résultats et interprétations de la mise en culture : Milieu de culture Résultats Interprétation PCA Tapis Ce milieu permet le développement de diverses bactéries non exigeantes d’où l’observation d’un tapis confirme la présence de différents types de bactéries. Gélose SS deux colonies noires L’apparition de deux colonies noires montre la présence de germe Salmonella King A Présence des colonies L’apparition de colonies permet d’affirmer la présence des entérobactéries Institut Supérieure de Biotechnologique de Sfax ISBS Kligler Présence des colonies La présence des colonies dans ce milieu permet d’identifier les entérobactéries 4. Résultat de l’antibiogramme : L’antibiogramme permet de définir, pour chaque antibiotique : Si la uploads/Geographie/ tp2-etude-cytologique-des-urines.pdf