Remerciez-le!

Remerciez @Admin pour avoir partagé cet document gratuitement, de la manière la plus simple, en partageant sur les réseaux sociaux.

COM DETECTAR LA SÍNDROME DE L’X FRÀGIL? LA DETECTEM A DOS MEMBRE D’UNA FAMÍLIA

COM DETECTAR LA SÍNDROME DE L’X FRÀGIL? LA DETECTEM A DOS MEMBRE D’UNA FAMÍLIA VOLUNTÁRIA Paula Boqué, Carlos Calvo, Jordi Diéguez, Sandra Martín i Paula Monzón. Abstract: Després d’una exhaustiva investigació per a la demostració de l’existència d’una malaltia monogènica com és el síndrome de l’X fràgil en una família de 5 membres, vàrem concloure a partir de diversos mètodes i tècniques de laboratori des de l’extracció del ADN fins la demostració final de resultats on es van apreciar els membres de la família que sí estaven afectats per la malaltia i descartar en els que no hi apareixia el gen FMR1 mutat. Keywords: gen FRM1, síndrome X fràgil, repetició triplets CGG, ADN, malaltia monogènica Introducció: La síndrome X fràgil és una malaltia monogènica també coneguda com a Síndrome de Martin-Bell, es causada per una mutació al gen FMR-1 del cromosoma X concretament, al braç llarg del cromosoma. Aquest gen es caracteritza per la repetició dels triplets CGG. En condicions normals, els triplets es repeteixen de 6 a 54 cops, mentre que en persones afectades es repeteixen més de 200 cops provocant així que el gen es desactiva i no es produeixi la proteïna corresponent. Els individus que presenten de 55 a 200 repeticions del segment CGG es diu que tenen una premutació del gen FMR-1. Per tant, els individus premutats no expressen una mutació completa, és a dir, tenen un menor grau de discapacitat mental i conseqüentment, expressen parcialment els seus símptomes. D’altra banda els individus els quals superen les 200 repeticions del triplet CGG, expressen completament la mutació, és a dir, tenen una completa discapacitat mental i en conseqüència manifesten absolutament els símptomes. (Monzó C., et al 2017) Principalment, és una patologia associada al cromosoma X que poden patir tant homes com dones; en el sexe masculí si ha sigut transmès es veurà directament afectat, en canvi, en les dones al tenir dos cromosomes X necessita que els seus dos progenitors en siguin portadors per poder-se veure afectada. A continuació es veuran els diferents i complexos processos realitzats al llarg de la investigació per a la determinació del síndrome X fràgil les mostres de sang de 5 membres d’una família voluntària la qual volia descobrir si en el seu ADN podia existir aquesta malaltia monogènica. Així mateix, en cas de trobar una també ens hem enfocat en l’origen patern de la malaltia, és a dir, si la malaltia era transmesa pel pare o per la mare. L’estudi d’aquesta malaltia va fer possible optimitzar el temps i material a través del protocol que es va seguir. Fins i tot, va proporcionar una obtenció d’ADN amb una qualitat elevada i absència de residus. Mètodes: Extracció: Es van realitzar 5 extraccions de sang perifèrica de tota la família, les quals es van dipositar en un tub d’assaig i posteriorment es va afegir la solució de lisi d’eritròcits per eliminar les plaquetes i el trencament de la membrana dels hematies a la dissolució i la seva posterior alliberació de l’hemoglobina en el sobrenedant, la qual causa interferències a les lectures. Darrerament es van afegir solucions de lisi cel·lular per al trencament de la membrana dels leucòcits i la seva consegüent alliberació del ADN. Ja obtingut el ADN en un tub d’assaig es tenia que assegurar de que es trobava sense impureses perquè es pogués tractar de manera adequada i poder continuar amb el procés sense resultats erronis. Purificació: Una vegada els àcids nucleics es van extreure de les 5 mostres, es va passar a realitzar la purificació de l’ADN la qual implica la separació de l’ADN de proteïnes i lípids mitjançant solvents orgànics i cicles de centrifugació. En primer lloc, es va afegir la barreja de Fenol:cloroform:alcohol isoamílic (25:24:1) aconseguint dissoldre les proteïnes i els lípids. Aquests van precipitar creant la fase orgànica i alliberant l’ADN a la fase aquosa gràcies a un cicle de centrifuga. En segon lloc, es va afegir el cloroform a la fase aquosa per tal de netejar l’ADN i es va tornar a centrifugar creant de nou una fase orgànica i una fase aquosa. A través de la fase aquosa es va determinar el volum de cada tub i es va afegir el doble del volum mesurat d’isopropanol; de nou els tubs van ser centrifugats fent precipitar l’ADN en forma de medusa al pellet i sobrenedant amb altres molècules. Un cop es va extreure el sobrenedant va incorporar-se als tubs etanol analític i van ser centrifugats per tal de rentar una altra vegada el pellet. Finalment, l’ADN de cada tub va ser resuspès agregant aigua destil·lada estèril. Tots els eppendorfs amb l’ADN mostraven un color clar sense restes d’hemoglobina i altres molècules i per tant, es va poder continuar amb el protocol establert. No obstant, en cas d’haver trobat restes als eppendorfs s’hauria d’haver tornat a realitzar la purificació per poder treballar amb resultats confiables Espectrofotòmetre: Després de tenir purificades les mostres del ADN es van determinar les seves concentracions en la solució i la puresa real a partir de l’absorbància en diferents unitats d’ona de l’espectrofotòmetre (230 nm, 260 nm, 280 nm i 320 nm). Amb les dades obtingudes es van restar les absorbàncies de 320 nm de les altres absorbàncies corresponents a cada mostra per eliminar la terbolesa de la solució en la fórmula. Es van fer els quocients corresponents de cada mostra (QUO:260/280) i (QUO:260/230) per a descartar qualsevols contaminació de carbohidrats, proteïnes, lípids, etc. Per altre banda també es van determinar les seves quantitats de ADN en la solució donat que per cada unitat d’absorbància en 260 nm equival a 50 ng/ul d’ADN. Els resultats donats en la prova d’espectrofotometria donaven peu a seguir endavant en la prova de PCR ja que aquests donaven tots un grau de puresa adequat i per tant eren perfectament idonis per seguir amb la següent prova sense cap tipus d’error. PCR: A partir de la PCR es va amplificar el gen FMR1 i es va poder observar l’absència o presència del gen, per tant també de la malaltia genètica. Abans de realitzar la PCR es van dissenyar els primers per amplificar la seqüencia del gen FMR1 de totes les mostres dels membres de la família. Al cercador PubMed seleccionarem l’opció “Gene” i introduirem FMR1, seleccionarem el gen d’humà amb el codi de referència ID: 1756. A partir de la pàgina Ensembl es va observar en la seqüència del gen dins del genoma humà. A continuació es va entrar a Primer3Plus i a partir de la seqüència que es va obtenir i amb les regions flanquejants es va obtenir el primer. Figura 1. Seqüenciació del gen FMR1 del Figura 2. Creació de primer. En blau tenim el primer genoma humà. Forward. En groc tenim el primer Reverse. A partir de la informació del primer es va enviar a l’empresa Invitrons per que els sintetitzessin i es van encarregar de manera líquida. Tenint ja els primers es va preparar la màster mix i es va introduir al termociclador per escalfar i refredar els tubs controlant la temperatura. El termociclador es va configurar de la següent manera: A continuació es van extreure les mostres amplificades del termociclador. Per verificar que la PCR es va realitzar correctament es va realitzar una electroforesi en gel, aquesta consisteix en introduir les mostres d’ADN als pous en un extrem del gel i aplicar corrent elèctrica per fer que les mostes corrin a través del gel segons la seva mida, fent així que els fragments d’ADN quedin separats. Quan el gel es tenyeix amb un pigment que s’uneix a l’ADN, els fragments d’ADN poden veure’s com bandes, les quals representen fragments d’ADN de la mateixa mida, indicant així les còpies del fragment FMR1. En un dels pous es va introduir un marcador amb fragments d’ADN de longituds conegudes que va servir de referència per poder comparar amb l’ADN de la família. Seqüenciació: A partir de la PCR es va realitzar una seqüenciació de l’ADN que va ajudar a trobar el gen alterat. Quan es va aconseguir l’ADN dels 5 pacients es va introduir el fragment FMR1 de cada ADN a la seqüenciadora, aquest procediment tracta de realitzar moltes còpies d’aquest fragment, posteriorment es va afegir àcids fluorescents i va començar el primer cicle, es va incorporar la primera base fluorescent i es van realitzar moltes còpies de cada grup. Quan es va observar a un punt fluorescent molt intens es va captar la imatge i es va procedir a l’extracció de la fluorescència de la primera base. Es va repetir aquest cicle fins a llegir tot el fragment. Per últim des de l’ordinador es van unir aquests fragments tal i com estava la informació original i es va traduir en text original. Resultats: A l’hora de obtenir els resultats de les proves anteriorment esmentades es van comparar amb altres articles (Saúl Lindo-Samanamud, et.al 2013) on a part de la informació dels procediments, es buscava una tècnica d’amplificació de seqüència de les bases per PCR. -Resultats obtinguts en el espectrofotòmetre: PARE MARE FILLA 1 FILLA 2 uploads/Geographie/boque-calvo-dieguez-martin-monzon-1lab-projecte4-f4-article-final.pdf