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Chapitre 5. Contrôle du développement embryonnaire 2. Identification des molécu

Chapitre 5. Contrôle du développement embryonnaire 2. Identification des molécules impliquées dans l’induction du mésoderme Méthodes pour identifier les molécules inductrices Méthodes pour localiser les molécules inductrices Hybridation moléculaire (basée sur la propriété d’appariement entre les bases complémentaires de l’un des deux brins de la molécule d’ADN et de celles de l’ARNm) Immunodétection (réalisée sur des coupes histologiques) EXERCICE DE RECHERCHE: En quoi consiste chacune des deux techniques: Fiche d’une page pour chaque technique Chapitre 5. Contrôle du développement embryonnaire 2. Identification des molécules impliquées dans l’induction du mésoderme Méthodes pour identifier les molécules inductrices Méthodes pour tester les fonctions des molécules inductrices Réalisée lorsque la molécule a été localisée au bon endroit In vitro: Exp (a) : Cellules compétentes de la calotte animale en culture en présence de la molécule à tester - Analyses histologiques : observation de cellules du mésoderme - Analyses moléculaires pour observer des marqueurs spécifiques (protéines ou ARNm) du mésoderme (ventral ou dorsal) Chapitre 5. Contrôle du développement embryonnaire 2. Identification des molécules impliquées dans l’induction du mésoderme Méthodes pour identifier les molécules inductrices Méthodes pour tester les fonctions des molécules inductrices Réalisée lorsque la molécule a été localisée au bon endroit In vivo: Exp (b et c) : soit expériences de perte de fonction (sous- expression) ou de gain de fonction (surexpression) de la molécule / Soit rendre la protéine inactive et analyser les phénotypes générés - Cibles (éléments manipulés): ADN ou ARNm ou protéine - Modification de l’ADN protéine mutée inactive ou absente: Méthode Knock-out (KO) Chapitre 5. Contrôle du développement embryonnaire 2. Identification des molécules impliquées dans l’induction du mésoderme Méthodes pour identifier les molécules inductrices Méthodes pour tester les fonctions des molécules inductrices Réalisée lorsque la molécule a été localisée au bon endroit Chapitre 5. Contrôle du développement embryonnaire 2. Identification des molécules impliquées dans l’induction du mésoderme Méthodes pour identifier les molécules inductrices Méthodes pour tester les fonctions des molécules inductrices Pour (b): c’est une expérience de perte de fonction qui consiste à obtenir la dégradation de l’ARNm d’une protéine en fournissant à l’embryon ou à la cellule des ARN antisens (ARN interférent) ou des oligonucléotides antisens (ADN) - Il se forme des duplex ARN-ARNm ou Adn-ARNm qui seront dégradés dans la machinerie cellulaire: donc pas de production de la protéine Autre possibilité pour (b) : blocage de la traduction de l’ARNm cible: injection de morpholinos (oligonucléotide antisens très stable) qui s’apparient spécifiquement à l’ARNm cible et bloque sa traduction par encombrement stérique): résultat sous-expression ou absence de la fonction Inactivation de protéine possible par Injection d’anticorps spécifique qui bloque sa fonction Chapitre 5. Contrôle du développement embryonnaire 2. Identification des molécules impliquées dans l’induction du mésoderme Méthodes pour identifier les molécules inductrices Méthodes pour tester les fonctions des molécules inductrices Pour (c) et (d) : expérience de gain de fonction : injection de l’ARNm de la protéine à tester soit dans un embryon traité à l’UV soit de façon ectopique (ie dans un blastomère qui n’exprime naturellement pas la protéine d’intérêt) - L’ARN injecté va être immédiatement traduit et la protéine sera produite en excès (surexpression) - Vérification: L’analyse de des phénotypes obtenus permettra de caractériser l’inducteur testé Chapitre 5. Contrôle du développement embryonnaire 2. Identification des molécules impliquées dans l’induction du mésoderme Méthodes pour identifier les molécules inductrices Méthodes pour tester les fonctions des molécules inductrices Pour (c) et (d) : expérience de gain de fonction : injection de l’ARNm de la protéine à tester soit dans un embryon traité à l’UV soit de façon ectopique (ie dans un blastomère qui n’exprime naturellement pas la protéine d’intérêt) Chapitre 5. Contrôle du développement embryonnaire 2. Identification des molécules impliquées dans l’induction du mésoderme Encart : Création de mutations nulles (souris knock-out) Méthode Pour - Il Chapitre 5. Contrôle du développement embryonnaire 2. Identification des molécules impliquées dans l’induction du mésoderme Encart : Création de mutations nulles (souris knock-out) Méthode Pour - Il Chapitre 5. Contrôle du développement embryonnaire 2. Identification des molécules impliquées dans l’induction du mésoderme Encart : Création de mutations nulles (souris knock-out) Méthode Pour - Il Chapitre 5. Contrôle du développement embryonnaire 2. Identification des molécules impliquées dans l’induction du mésoderme Encart : Création de mutations nulles (souris knock-out) Méthode Pour - Il Chapitre 5. Contrôle du développement embryonnaire 2. Identification des molécules impliquées dans l’induction du mésoderme Encart : Création de mutations nulles (souris knock-out) Méthode Pour - Il Chapitre 5. Contrôle du développement embryonnaire 2. Identification des molécules impliquées dans l’induction du mésoderme Méthodes pour identifier les molécules inductrices Méthode pour tester les fonctions des molécules inductrices Méthode du dominant-négatif (DN) - Principe : rendre non fonctionnel le récepteur de l’inducteur étudié en faisant produire par l’embryon ou la cellule étudiée, le récepteur muté de l’inducteur - Réalisation : un ARNm codant le récepteur dépourvu de son domaine cytoplasmique est fabriqué par génie génétique et fourni à l’embryon ou à la cellule par microinjection. La traduction de l’ARNm produit en excès le récepteur muté par rapport au récepteur endogène (DN) - Résultat : pas de transduction du signal et donc pas d’induction - Vérification : analyse des phénotypes obtenus - Méthode adaptée pour les amphibiens, chez lesquels il n’y a pas de moyen de réaliser des mutations génétiques (KO) par opposition à la souris uploads/Management/ chapitre-5-techniques-d-x27-etudes-des-molecules-inductrices-1.pdf