L3-USTHB Techniques d’Analyse 1 La chromatographie La chromatographie (du grec
L3-USTHB Techniques d’Analyse 1 La chromatographie La chromatographie (du grec ancien khrôma, « couleur » et / graphein, « écrire ») est une méthode physico-chimique qui sert à séparer les différentes substances présentes dans un mélange (échantillon en phase homogène liquide ou gazeuse) L'appareil utilisé pour effectuer certaines chromatographies se nomme chromatographe. L'image ou le diagramme obtenu par chromatographie est appelé chromatogramme. Lorsqu'on utilise un chromatographe et un logiciel de chromatographie, le chromatogramme prend généralement la forme d'un graphique qui traduit la variation d’un paramètre relié à la concentration du soluté en sortie de colonne, en fonction du temps (ou du volume) d’élution Le botaniste russe Mikhail Tswett fut, en 1906, le premier à utiliser le terme« chromatographie ». Tswett utilisait depuis 1903 des colonnes d'adsorption pour séparer des pigments de plantes. On spécula donc l'étymologie du mot « chromatographie » à partir du grec ancien khrôma, « couleur » et donc pigment. Toutefois, Tswett ne donna jamais cette explication, mais tswett est le mot russe pour « couleur ». En 1906 un chimiste russe, Tswett, a séparé des pigments végétaux colorés sur une colonne remplie de carbonate de calcium pulvérulent, les pigments étaient entraînés avec de l'éther de pétrole (mélange pentanes et d’hexanes). Il a observé sur la colonne la formation de bandes de couleur différente (vert, orange, jaune..). Il a donné à cette technique le nom de chromatographie (écriture des couleurs). Il a défini également les termes : chromatogramme, élution, rétention. Cette technique fut quasi-abandonnée jusqu'en 1930, où Edgar Lederer a purifié par la méthode de Tswett la lutéine du jaune d’œuf. Vers 1940, Martin et Synge développent la pratique et la théorie de la chromatographie, ils obtiennent le prix Nobel en 1952 En 1952, mise au point de la Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG). En 1968, mise au point de la Chromatographie Liquide Haute Performance CLHP ou HPLC en anglais. La chromatographie repose sur l'entraînement d'un échantillon dissous par une phase mobile (ou éluant) à travers une phase stationnaire (ou phase fixe). La phase stationnaire, fixée soit sur la surface intérieure d'une colonne soit sur une surface plane, retient plus ou moins fortement les substances contenues dans l'échantillon dilué selon l'intensité des forces d'interactions de faible énergie (comme les forces de Van der Waals, les liaisons hydrogène, etc.) réalisées entre les différentes espèces moléculaires et la phase stationnaire. Selon la technique chromatographique mise en jeu, la séparation des composants entraînés par la phase mobile, résulte soit de leur adsorption et de leur désorption successives sur la phase stationnaire, soit de leur solubilité différente dans chaque phase. L3-USTHB Techniques d’Analyse 2 Les différents types de chromatographie • chromatographie sur couche mince (CCM ou TLC en anglais) ; • chromatographie en phase gazeuse (CPG ou GC en anglais) également appelée CPV (chromatographie en phase vapeur) ; • chromatographie en phase liquide (CPL ou LC en anglais) ; • chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP ou HPLC en anglais) ; La chromatographie en phase gazeuse Technique de séparation applicable aux composés gazeux ou susceptibles d’être volatilisés par élévation de T°. Elle est limitée aux composés thermostables et suffisamment volatils (MM<300) ➢ Les gels de silice : C’est la phase stationnaire la plus utilisée en chromatographie et notamment en C.L.H.P Le gel de silice est constitué de micro sphères de diamètre sensiblement constant pouvant varier de 2 à 5 µm. Les gels de silice sont stables dans une grande gamme de pH mais ils ne supportent pas des pH trop extrêmes. Il y a des risques de dissolution pour des pH trop acides ou trop basiques, on se limite donc a la gamme 2 < pH < 12. Des gels spéciaux existent pour une utilisation à pH extrêmes. La qualité d’un gel dépend de plusieurs paramètres : taille des grains, porosité ouverte (dimensions et répartition des pores), résistance à l’écrasement, surface spécifique… Les gels courants pour C.L.H.P ont les caractéristiques suivantes : diamètre de 2 à 5 µm, résistance à l’écrasement sous 1000 bars, surface spécifique 350 m2/g, porosité 0,7 mL / g , taille des pores 10 nm. L3-USTHB Techniques d’Analyse 3 CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE: H.P.L.C La chromatographie liquide haute performance est très utilisée dans tous les domaines de la chimie analytique. Son succès est du au fait qu’il est possible de modifier la résolution en jouant sur la composition de la phase mobile. Elle utilise des colonnes remplies d’une phase stationnaire constituée de particules sphériques de très petites dimensions de diamètre couramment compris entre 2 et 5 µm ce qui conduit à de grandes efficacité et résolution. L’inconvénient est que plus les particules sont petites et plus il est difficile de faire s’écouler le solvant, on doit donc utiliser des pompes spéciales qui poussent le solvant sous des pressions très élevées. A l’origine le P de H.P.L.C correspondait donc au mot Pression. La grande efficacité de la technique fait que le P désigne actuellement le mot Performance. Les pompes doivent répondre aux exigences suivantes : fournir des pressions élevées jusqu'à 400 bars. Débit stable, et réglable de 0,1 à 10 mL/min. résistance à la corrosion quelque soit le solvant utilisé La pression à imposer dépend des facteurs suivants : - débit de la phase mobile - viscosité de l’éluant - taille des grains de la phase stationnaire - géométrie de la colonne La phase normale: La phase normale est constituée de gel de silice. Ce matériau est très polaire. Il faut donc utiliser un éluant apolaire. Ainsi lors de l'injection d'une solution, les produits polaires sont retenus dans la colonne, contrairement aux produits apolaire qui sortent en tête. L'inconvénient d'une telle phase, c'est une détérioration rapide au cours du temps du gel de silice, ce qui entraîne un manque de reproductibilité des séparations. La phase inverse : La phase inverse est majoritairement composée de silice greffée par des chaînes linéaires de 8 ou 18 atomes de carbones (C8 et C18). Cette phase est apolaire et nécessite donc un éluant polaire. Dans ce cas, ce sont les composés polaires qui seront élués en premier. Contrairement L3-USTHB Techniques d’Analyse 4 à une phase normale, il n'y a pas d'évolution de la phase stationnaire au cours du temps, et la qualité de la séparation est donc maintenue constante. Si la phase stationnaire est polaire, on utilisera une phase mobile peu polaire la chromatographie est dite en phase normale ; Si la phase stationnaire est très peu polaire, on choisira une phase mobile polaire ( le plus souvent des mélanges de méthanol ou d'acétonitrile avec de l'eau), c'est la chromatographie en phase inverse. En modifiant la polarité de la phase mobile, on agit sur les facteurs de rétention des composés. Comparaison CPG – HPLC CPG HPLC - Séparation en phase gazeuse - Composés volatils et non thermolabiles - Séparation à température élevée - Sélectivité limitée - Séparation en phase liquide - Indifférent - Séparation à température ambiante - Grande latitude d’ajustement des sélectivités Ces deux Techniques analytiques sont de routine, Travail sur des quantités infimes de produits. Domaines d’applications variés. Possibilité de coupler la technique avec d’autres méthodes analytiques (AA, SM, IRTF…) Chromatographie sur couche mince (CCM) ➢ Définition et appareillage: La chromatographie sur couche mince (CCM) repose principalement sur des phénomènes d'adsorption : la phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants, qui progresse le long d'une phase stationnaire fixée sur une plaque de verre ou sur une feuille semi-rigide de matière plastique ou d'aluminium. Après que l'échantillon ait été déposé sur la phase stationnaire, les substances migrent à une vitesse qui dépend de leur nature et de celle du solvant. Les principaux éléments d'une séparation chromatographique sur couche mince sont: • la cuve chromatographique : un récipient habituellement en verre, de forme variable, fermé par un couvercle étanche. • la phase stationnaire : une couche d'environ 0,25 mm de gel de silice ou d'un autre adsorbant est fixée sur une plaque de verre à l'aide d'un liant comme le sulfate de calcium hydraté plâtre, l'amidon ou un polymère organique. l'échantillon : environ un microlitre (µl) de solution diluée ( 2 à 5 %) du mélange à analyser, déposé en un point repère situé au-dessus de la surface de l'éluant. l'éluant : un solvant pur ou L3-USTHB Techniques d’Analyse 5 un mélange : il migre lentement le long de la plaque en entraînant les composants de l'échantillon. ➢ Principe de la technique. Lorsque la plaque sur laquelle on a déposé l'échantillon est placée dans la cuve fermée, l'éluant monte à travers la phase stationnaire, essentiellement par capillarité. En outre, chaque composant de l'échantillon se déplace à sa propre vitesse derrière le front du solvant. Cette vitesse dépend d'une part, des forces électrostatiques retenant le composant sur la phase stationnaire et, d'autre part, de sa solubilité dans la phase mobile. Les composés se déplacent donc alternativement de la phase stationnaire à la phase mobile, l'action de rétention de la phase stationnaire étant principalement contrôlée par des phénomènes d'adsorption. L3-USTHB Techniques d’Analyse 6 L3-USTHB Techniques d’Analyse 7 Chromatographie en uploads/Management/ cours-ta-1-2021 1 .pdf
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- Publié le Nov 17, 2022
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