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الـجمهوريــة الـــجزائريـــة الــــديمقراطيـــة الـــشعـبيـــة وزارة التعليـم ا

الـجمهوريــة الـــجزائريـــة الــــديمقراطيـــة الـــشعـبيـــة وزارة التعليـم العالي والبحـث العلمـي People’s Democratic Republic of Algeria Ministry of Higher Education and Scientific Research University of Algiers 1 Benyoucef BENKHEDDA Faculté des Sciences Département de SNV Exposé préparé dans le cadre de l’unité Master en Microbiologie Appliquée Présenté par les étudiantes du groupe 4 : - Toudji Sabrine - SEKHI Nesrine - SELMANI Ikrame - SELMI Yasmine Thème N ; Année universitaire : 2021–2022 Plan de travail : I. Introduction II. Principe de la spectrométrie de masse Maldi-Tof III. Les étapes de la technique Maldi-Tof IV. Interprétation de résultat de la méthode Maldi-Tof V. Les Application Médicale de le spectrométrie de masse Maldi-Tof VI. Conclusion Liste des Figure : Figure 1 : Appareil de Maldi-Tof Figure 2 : Préparation de l’échantillon pour les Analyse de Maldi- Tof Figure 3 : Les Etapes de la spectrométrie de masse Maldi-Tof Figure 4 - Exemples de spectres obtenus par MALDI-TOF Figure 5 : Tableaux des avantages et des inconvénients de la technique I. Introduction : Depuis des décennies, les micro-organismes potentiellement en cause dans les manifestations cliniques infectieuses étaient identifiés par des techniques traditionnelles basées sur l’étude du métabolisme bactérien. Ces techniques présentaient certains inconvénients tels que de nécessiter plusieurs heures de délai d’analyse ou encore de devoir disposer de suffisamment de matériel biologique issu des cultures pour être réalisées. Les premières études de l’identification des micro-organismes par la méthode d’analyse MALDI TOF (matrix-associated LASER désorption and ionisation, time of flight) ont débuté dans les années 1990. L’avènement de systèmes informatiques plus performants et la constitution de base de données ont permis la commercialisation en 2008 des premiers systèmes d’identification de routine aux laboratoires d’analyses médicale. . Figure 1 : Appareil de Maldi-Tof La technologie MALDI TOF ne nécessite qu’une petite quantité de colonie des cultures du micro-organisme et une goutte de matrice pour réussir à réaliser l’identification bactérienne en quelques minutes et pour un coût modéré. Une abondante littérature vante les résultats obtenus par cette technique. Les études relèvent que cette technique a prouvé sa pertinence d’analyse pour les bactéries d’identification de routine en laboratoire de bactériologie . De récentes études ont également démontré que la technique MALDI TOF était prometteuse pour l’identification des micro-organismes difficiles à identifier , des levures (, des anaérobies et des micro organismes de culture fastidieuse . La spectrométrie de masse MALDI TOF est une nouvelle technique qui révolutionne la microbiologie et qui devrait prochainement remplacer la plupart des systèmes d’identification traditionnels. II. Principe : Principe de la méthode d’identification : La spectrométrie de masse MALDI-TOF (matrix- associated LASER desorption and ionisation, time of flight) : est une technique d'analyse permettant de détecter et d'identifier des molécules par mesure de leur « temps de vol » (proportionnel à leur masse et à leur charge). Son principe réside dans la séparation en phase gazeuse de molécules en fonction de leur rapport masse/charge (m/z). Le spectromètre de masse comporte une source d'ionisation (le laser) suivie d'un analyseur qui sépare les ions produits selon leur rapport m/z, d'un détecteur qui compte les ions, et enfin d'un système informatique pour traiter le signal. Le résultat obtenu est un ensemble de pics ou spectre de masse représentant les rapports m/z des ions détectés selon l'axe des abscisses et l'intensité relative de ces ions selon l'axe des ordonnées. Ce spectre de masse peut alors être comparé aux milliers de spectres de référence contenus dans la base de données de l'appareil et semble spécifique d'espèce. III. Les Etapes : L’identification MALDI-TOF est réalisée sur les colonies d’intérêt isolées à partir des milieux de culture. La colonie à identifier est prélevée à l’aide d’un cône . La première étape consiste à mélanger l’échantillon à la matrice, l’évaporation des solvants conduisant à la cristallisation de la matrice avec l’échantillon. Le mélange ainsi formé est déposé sur un support (plaque métallique). Plusieurs techniques de dépôt existent : - les préparations en « couches minces » : l’échantillon est déposé sur une couche de matrice préalablement déposée sur la plaque cible pour former de larges films minces polycristallins . - les préparations en « gouttes épaisses » ou « gouttes sèches » : matrice et échantillon sont mélangés soit dans un tube puis déposés sur la plaque cible, soit directement sur la plaque cible . - les préparations en « sandwich » : l’échantillon est déposé sur un film de matrice avant d’être lui-même recouvert par une dernière couche de matrice. Une fois les échantillons déposés sur la cible, cette dernière est introduite dans le spectromètre de masse. Les paramètres expérimentaux : méthode d’extraction des protéines, concentration en NaCl, composition des tampons utilisés, conditions de culture, nature du dépôt (goutte séchée, couche mince, etc.) influencent la qualité des spectres en modifiant la cristallisation de la matrice avec l’échantillon et, par conséquent, l’efficacité d’ionisation des molécules testées. Maîtriser et standardiser ces variables permet d’optimiser l’identification et d’augmenter la reproductibilité. Le choix de la matrice utilisée est un paramètre important. Elle doit être adaptée à la nature de l’échantillon et répondre à certains critères physico-chimiques pour obtenir un bon rendement d’ionisation et un spectre de bonne résolution. Les matrices les plus utilisées sont l’acide 2,5-dihydroxybenzoïque (acide gentisique ou DHB), l’acide trans-3,5-diméthyloxy-4-hydroxycinnamiq acide sinapinique ou SA) et l’acide α-cyano-4-hydroxycinnamique (α-CHCA). . . . Figure 2 : Préparation de l’échantillon pour les Analyse de Maldo-Tof Le processus analytique peut se résume en 3 étapes : 1) l’ionisation : Le frottis cocristallisé avec la matrice permet la diffusion homogène du rayonnement de la source d'ionisation (dans notre cas d'un faisceau laser à azote). Les molécules de matrice absorbent l'énergie transmise par le laser sous forme de photons UV, s'excitent et s'ionisent. 2) -la séparation des ions : L'énergie absorbée par la matrice provoque sa dissociation et sa désorption. Les molécules de matrice ionisées transfèrent leur charge à l'échantillon. L'expansion de la matrice entraîne l'échantillon au sein de la phase gazeuse dense où il finira de s'ioniser. Les composés ionisés issus des protéines bactériennes vont être accélérés par un champ électrique dans une colonne, avant de pénétrer dans un tube de vol, libre de tout champ permettant de séparer les molécules selon leur rapport m/z 3) -la détection: Celle-ci est réalisée grâce à un multiplicateur d'électrons. Le signal est amplifié par la formation d'électrons secondaires à l'aide de tubes en verre dopés au plomb (dynode). Lorsqu'un composé ionisé entre dans un canal et percute sa paroi, il provoque l'émission de plusieurs électrons qui sont accélérés par la tension de polarisation. Les électrons émis vont à leur tour frapper la paroi et provoquer l'émission d'autres électrons. Ainsi, plus la quantité d'ions de rapport m/z est importante, plus le nombre d'électrons secondaire est important et plus l'intensité du pic de même rapport m/z est important. Les pics enregistrés sont représentés sous la forme d'un spectre, spécifique d'espèce. Figure 3 : Les Etapes de la spectrométrie de masse Maldi-Tof IV. Interprétations des résultats La technique de la spectrométrie de masse MALDI-TOF marques résulta sur un logiciel [le Biotyper TM 1.1] pour l’identification et l’analyse et la classification de spectres, Le BiotyperTM 1.1 offre trois approches différentes : MSP (Main Spectra Projection) qui retient tous les spectres avec un bruit de fond égal à 0,1, et , PCA (Principal Component Analysis) utilisé pour la classification des bactéries soit en dendrogrammes, soit en deux ou en trois dimensions et qui ne retient que les 70 pics majoritaires et enfin, CCI (Component Corrélation Index) qui est une méthode statistique pour l’analyse des relations entre les spectres . Ce fameux logiciel permet de générer différentes banques de données pour produire à partir des spectres, des listes de pics ou des références de spectres La banque de données est constituée d’un nombre restreint de pics pour chaque espèce bactérienne. - Il existe pour chaque espèce bactérienne une seule ou un nombre restreint d’entrées, couvre les germes habituels, mais aussi les mycobactéries, les dermatophytes ainsi que les différentes espèces d’Aspergillus et les levures . Notons qu’actuellement, seule cette base de données offre la possibilité d’identifier les mycobactéries. le pourcentage d’identification correcte au genre des espèces les plus fréquemment isolées varie de 87 % à 99%. - Par contre Les entérobactéries ne posent pas de problème majeur avec une identification correcte de l’espèce dans 97 % à 99 % des échantillons selon les études. Un point délica reste l’identification des Shigella sp, dont les spectres ne sont pas présents dans toutes les bases de données, il faut noter aussi que Parmi les cocci à Gram positif, les streptocoques du groupe mitis sont particulièrement difficiles à identifier et à distinguer de Streptococcus pneumonie . on note que l’identification des bactéries directement à partir des prélèvements, se fait soit à partir de flacons d’hémocultures détectés comme positifs, soit à partir des urines. Dans le cas des hémocultures poly microbiennes, les spectres obtenus sont plus difficiles à interpréter et, dans le meilleur des cas, le germe prédominant est identifié. Sans oublier de citer qu’il est envisageable , à partir des uploads/Management/ l-gmhory-l-gz-ry-l-dymkr-ty-l-shaa-by.pdf