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Méthode d’analyse Dénombrement des salmonelles : méthode par tubes multiples MA

Méthode d’analyse Dénombrement des salmonelles : méthode par tubes multiples MA. 700 – Sal-tm 1.0 Édition : 1999-04-29 Révision : 2003-11-26 (1) Centre d’expertise en analyse environnementale du Québec Exemple de numérotation : MA. 203 - As 1.1 Méthode d'analyse approuvée 100 - Propriétés 200 - Métaux 300 - Matières inorganiques non-métalliques 400 - Matières organiques 500 - Toxicologie 700 - Microbiologie 800 - Biologie 900 - Terrain 1000 - Agricole 00 - Général 01 - Air ambiant 02 - Rejets atmosphériques 03 - Eau potable, eaux naturelles, etc. 04, 14, 15 - Eaux usées (municipales, industrielles, etc.) 05, 10, 16 - Sols ou sédiments 06 - Tissus végétaux 07 - Tissus animaux 08, 09, 13 - Résidus (déchets, huiles, boues, etc.) 17 - Précipitations acides Identification du paramètre Numéro de la méthode Numéro de l'édition MA. 700 – Sal-tm 1.0 3 de 19 ÉDITION APPROUVÉE LE : 29 avril 1999 Historique de la méthode Cette méthode a été élaborée et implantée dans le laboratoire de microbiologie du Centre d'expertise en analyse environnementale du Québec (CEAEQ) pour effectuer la recherche et le dénombrement des salmonelles dans les échantillons solides et liquides. Elle utilise le milieu de culture DSE pour l’enrichissement avec la technique des tubes multiples, le milieu gélosé XLT4 pour isoler les colonies probables de salmonelles à partir des tubes d’enrichissement et des galeries biochimiques d’identification pour confirmer l’appartenance des colonies isolées au genre Salmonella. L’élaboration de cette méthode a été initiée pour appuyer les Critères provisoires pour la valorisation des matières résiduelles fertilisantes (MENV, 2002). L'approche employée dans cette méthode est similaire à l'approche présentée dans le document Control of Pathogens and Vector Attraction in Sewage Sludge (USEPA, 1999) dans à la section Appendix F – Sample Preparation for Fecal Coliform Tests and Salmonella sp. Analysis. Dans ce document, l'USEPA reproduit une méthode de Kenner et Clark (1972) qui utilise le milieu de culture DSE pour l’enrichissement, le milieu XLD pour l’isolement des colonies probables des salmonelles et divers tests biochimiques pour la confirmation des salmonelles. La technique employée dans cette méthode pour la détermination de la siccité (pourcentage de matières sèches) s’appuie sur la méthode 2540B du manuel de référence Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (APHA, AWWA et WEF, 1998). Cette édition révisée de la méthode ne contient pas de modification dans la procédure analytique; les modifications apportées à l’historique et à la bibliographie constituent les seuls changements effectués à l’édition originale du 29 avril 1999. Reproduction et traduction, même partielles, interdites sans l'autorisation du Centre d'expertise en analyse environnementale du Québec, ministère de l'Environnement du Québec. Ce document doit être cité de la façon suivante : CENTRE D’EXPERTISE EN ANALYSE ENVIRONNEMENTALE DU QUÉBEC, Dénombrement des salmonelles ; méthode par tubes multiples. MA. 700 – Sal-tm 1.0, Ministère de l’Environnement du Québec, 2003, 19 p. MA. 700 – Sal-tm 1.0 5 de 19 TABLE DES MATIÈRES INTRODUCTION 7 1. DOMAINE D’APPLICATION 7 2. PRINCIPE ET THÉORIE 7 3. FIABILITÉ 8 3.1. Interférences 8 3.2. Limite inférieure de quantification 8 3.3. Limite supérieure de quantification 8 3.4. Fidélité 8 3.5. Pourcentage de récupération 9 4. PRÉLÈVEMENT ET CONSERVATION 10 5. APPAREILLAGE 10 6. MILIEUX DE CULTURE ET RÉACTIFS 11 7. PROTOCOLE D’ANALYSE 14 7.1. Préparation de l’échantillon 14 7.2. Analyse de l’échantillon 14 7.3. Observation des résultats 15 7.4. Confirmations biochimiques 16 7.5. Détermination du pourcentage de matières sèches 16 8. CALCUL ET EXPRESSION DES RÉSULTATS 16 9. CRITÈRES D’ACCEPTABILITÉ 18 10. BIBLIOGRAPHIE 19 MA. 700 – Sal-tm 1.0 7 de 19 INTRODUCTION En avril 1997, le document « Critères provisoires pour la valorisation des matières résiduelles fertilisantes (épandage, entreposage temporaire, compostage, fabrication et utilisation de terreaux) » a été produit par le Service de l’assainissement agricole et des activités de compostage de la Direction des politiques des secteurs agricole et naturel du ministère de l’Environnement et de la Faune. Ce document définit, entre autres, des critères de référence microbiologiques pour l’utilisation des matières résiduelles fertilisantes. Un de ces critères est basé sur le dénombrement des salmonelles, un groupe de microorganismes pathogènes. Les salmonelles appartiennent au groupe des Entérobactéries; elles sont en forme de bâtonnets Gram négatifs et sont anaérobies facultatives. Les salmonelles sont pathogènes pour l’humain et peuvent causer des fièvres entériques, des gastroentérites et des septicémies. Habituellement, dans une matrice comme l’eau de consommation, un dénombrement n’est pas nécessaire dans le cas des microorganismes pathogènes; seul un test présence-absence suffit. Dans le document intitulé « Critères provisoires pour la valorisation des matières résiduelles fertilisantes (épandage, entreposage temporaire, compostage, fabrication et utilisation de terreaux) », la norme pour les salmonelles est de < 3 NPP/4 g de matière sèche, et donc une méthode de dénombrement est nécessaire. La méthode décrite dans ce document utilise le principe de croissance en tubes multiples et est inspirée du document publié par l’USEPA « Control of pathogens and vector attraction in sewage sludge ». 1. DOMAINE D’APPLICATION Cette méthode consiste à dénombrer les salmonelles par croissance en tubes multiples. Elle s’applique aux résidus des fabriques de pâtes et papiers, aux composts domestiques ainsi qu’à toutes les matrices solides ou liquides. Cette méthode peut être utilisée également comme test présence-absence dans les cas où seulement un dépistage est requis. Habituellement, 25 g d’échantillon sont alors incubés dans 225 ml du bouillon d’enrichissement. Il est repiqué par la suite sur la gélose sélective. S’il y a des colonies caractéristiques, les confirmations biochimiques sont effectuées et nous pouvons ainsi déterminer s’il y a présence de salmonelles dans 25 g d’échantillon. 2. PRINCIPE ET THÉORIE Le principe de la méthode NPP (NPP signifie nombre le plus probable) consiste à ensemencer de nombreux volumes ou des dilutions d’un même échantillon dans des tubes de bouillon d’enrichissement et par la suite à confirmer la présence de salmonelles par repiquage des tubes sur gélose sélective. Chacune des géloses sélectives positives correspond à un tube d’enrichissement particulier. Le nombre le plus probable de salmonelles peut alors être estimé dans une quantité spécifiée d’échantillon à partir du nombre et de la répartition des tubes positifs. 8 de 19 MA. 700 – Sal-tm 1.0 3. FIABILITÉ 3.1. INTERFÉRENCES Les échantillons doivent être en suspension dans l’eau tamponnée stérile (suspension de départ) le moins longtemps possible, de préférence moins de 20 minutes, car il peut en résulter un changement de la population bactérienne initiale. Une bonne agitation de la suspension de départ et des tubes contenant l’échantillon est importante pour éviter une sous-évaluation du résultat final. Dans le cas d’échantillons liquides, les bouteilles d’échantillonnage de 250 ml remplies à pleine capacité doivent être rejetées, car elles ne permettent pas d’agiter l’échantillon de façon à disperser uniformément les bactéries présentes dans tout le volume initial. Le rejet d’une portion aliquote de l’échantillon au laboratoire risquerait de modifier la concentration initiale des bactéries par unité de volume d’échantillon et de fausser le résultat. L’analyse de tels échantillons doit faire l’objet d’une remarque à cet effet sur le rapport d’analyse. Pour chaque échantillon, un tube de chacune des dilutions de l’échantillon est inoculé avec des concentrations variant entre 10 et 100 UFC viables d’une souche de référence de salmonelles afin de vérifier la présence de substances inhibitrices (contrôle positif). 3.2. LIMITE INFÉRIEURE DE QUANTIFICATION La limite inférieure de quantification est de 1 NPP/4 g d’échantillon humide. Cependant, les résultats étant exprimés en NPP/4 g d’échantillon sec, cette limite peut varier. Par exemple, un échantillon ayant un pourcentage de matières sèches de 30 % a une limite inférieure de quantification de 3 NPP/4 g d’échantillon sec. Pour les échantillons ayant un pourcentage de matières sèches inférieur à 23 %, il faut augmenter la quantité d’échantillon et de milieu de culture afin de pouvoir respecter le critère de < 3 NPP/4 g d’échantillon sec en cas d’absence de salmonelles. 3.3. LIMITE SUPÉRIEURE DE QUANTIFICATION La limite supérieure de quantification est de 640 NPP/4 g d’échantillon humide. Cependant, les résultats étant exprimés en NPP/4 g d’échantillon sec, cette limite peut varier. Par exemple, un échantillon ayant un pourcentage de matières sèches de 30 % a une limite supérieure de quantification de 21 000 NPP/4 g d’échantillon sec. 3.4. FIDÉLITÉ 3.4.1. Réplicabilité Les valeurs de la réplicabilité se trouvent dans le tableau suivant. MA. 700 – Sal-tm 1.0 9 de 19 Matrice Nombre de données Réplicabilité Lisier de porc (liquide) n = 6 ± 33 NPP/ml à une concentration de 70 NPP/ml Compost (solide) n = 11 ± 5 NPP/g humide à une concentration de 22 NPP/g humide Boue municipale (solide) n = 9 ± 42 NPP/g humide à une concentration de 116 NPP/g humide Boue de fabrique de pâtes et papiers (solide) n = 10 ± 5 NPP/g humide à une concentration de 21 NPP/g humide 3.4.2 Répétabilité Les valeurs de la répétabilité se trouvent dans le tableau suivant. Matrice Nombre de données Répétabilité Lisier de porc (liquide) n = 10 ± 7 NPP/ml à une concentration de 28 NPP/ml Compost (solide) n = 10 ± 9 NPP/g humide à une concentration de 24 uploads/Management/denombrement-des-salmonelles-methode-par-tubes-multiples.pdf