Remerciez-le!

Remerciez @Admin pour avoir partagé cet document gratuitement, de la manière la plus simple, en partageant sur les réseaux sociaux.

Le Transcriptome • Introduction • Méthodes d’analyse du transcriptome • Puces à

Le Transcriptome • Introduction • Méthodes d’analyse du transcriptome • Puces à ADN : principe et méthodologie • CGH-array Transcriptome Protéome Métabolome Génome Définitions Evolutions technologiques et nouvelles approches • Les avancées technologiques ont entraînées une baisse significative des coûts de séquençage. • La robotisation permet de traiter plusieurs dizaines ou centaines de milliers de clones avec peu d’interventions humaines et en réduisant les erreurs de manipulation Développement d’outils de génomique • 1703 virus (dont 91 rétrovirus) • 382 bactéries + 643 en cours • 933 plasmides naturels • 459 organelles (81 chloroplastes, 1001 mitochondries) Organismes procaryotes entièrement séquencés et assemblés (05/06) • 9 champignons dont Saccharomyces cerevisiae (12.07 MB, 10/1996), Schizo. Pombe • 4 animaux : drosophile (180 MB, 03/2000), C.elegans (12/1998), homme (3038 MB, 12/1999), souris (2500, 07/2005) • 6 parasites dont plasmodium falciparum (23 MB, 11/1998), trypanosoma cruci (34 MB, 07/2005) • 2 plantes : Arabidopsis thaliana (119 MB, 12/2000), riz (430 MB, 12/2002) Organismes eucaryotes entièrement séquencés et assemblés (05/06) A ceux-la viennent se rajouter 112 organismes en assemblage et 181 en cours dont rat, chien, chat, vache, cochon, abeille, blé, tomate, orge, maïs, peuplier, poisson zèbre, fugu…… Nombre de gènes identifiés dans différents organismes • HIV-1 9 • Bactériophage Lambda 80 • Escherichia coli 4300 • Saccharomyces cerevisiae 6300 • C. Elegans 19000 • Drosophile 13600 • Arabidopsis thaliana 25500 • Hommo sapiens ~35000 Etape suivante: génomique fonctionnelle L’objectif des approches de génomique fonctionnelle est de répondre à la question suivante: quel est le rôle des gènes identifiés par les programmes de séquençage? Functional genomics: The development and application of global (genome- wide) experimental approaches to assess gene function by making use of the information provided by structural genomics. It is characterized by high throughput experimental methodologies combined with statistical and computational analysis of the results. The fundamental strategy is to expand the scope of biological investigation from studying single genes or proteins to studying all genes or proteins at once in a systematic fashion. [Phil Hieter and Mark Boguski "Functional Genomics: It's All How You Read It" Science 278: 601- 602, October 24, 1997] Comment assigner une fonction à un gène? Protéine déjà étudiée par des approches classiques. Gène dont la séquence, ou des motifs dans la séquence, présente des homologies avec des gènes de fonctions connues (dans le même organisme ou ailleurs!). C’est l’annotation par homologie de séquence (bioinformatique) Génétique inverse (on inactive le gène et on observe le résultat). Pb avec les gènes essentiels et les familles de gènes (compensation) Etude de l’expression des gènes (expression spatio-temporelle). Des gènes présentant un profil d’expression similaire peuvent être impliqués dans des processus commun. Transcriptome/protéome (annotation fonctionnelle) Localisation intracellulaire des protéines correspondantes (immunohistochimie, couplage GFP…) Exemple chez Arabidopsis thaliana • Près de 40% des gènes d’Arabidopsis n’ont pas de fonction biologique qui puisse leur être attribuée a priori sur la base de leur séquence (Multinational coordinated Arabidopsis thaliana functional genomics project, Juin 2002) • Moins de 10% des gènes étiquetés par T-DNA (KO du gène) donnent lieu à une variation visible du phénotype de la plante The Arabidopsis Genome Initiative, 2000 Nature, Vol. 408, p. 796-815 Nécessité d’étudier à grande échelle l’expression des gènes • pour savoir où et quand ils s’expriment (1ère annotation fonctionnelle) • pour étudier l’effet de conditions variées, de mutations connues ou inconnues sur des réseaux de régulation, des voies métaboliques complètes Développement d’outils d’étude du transcriptome et du protéome c-à-d. de l’expression des gènes par des approches globales. D’où ... Le Transcriptome • Introduction • Méthodes d’analyse du transcriptome • Puces à ADN : principe et méthodologie • PCR en temps réel • SAGE et séquençage d’EST • Séparation de fragments : DDRT-PCR • Macroarrays et microarrays II- METHODES D’ETUDE DU TRANSCRIPTOME • L’objectif de ces techniques est de mesurer simultanément dans un échantillon biologique (tissus normal, tumeurs) les espèces d’ARNm exprimés et leurs quantités respectives. • Il s’agit de méthodes globales (de 1000 à 40 000 gènes étudiés simultanément) qui permettent d’avoir des résultats qualitatifs (quels sont les gènes exprimés dans telle situation biologique) et quantitatifs (à quels niveaux sont-ils exprimés) La technique SAGE • Serial Analysis of Gene Expression • Technique basée sur deux principes – La représentation de chaque espèce d’ARNm par des étiquettes (tags) correspondant à de petites séquences (10-15 pb) – La concanétation de ses tags avant clonage et séquençage cDNA library Principe de la technique AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA SAGE library 1 clone = 1 mRNA 1 clone = 20 to 60 mRNAs Population d’ARNm AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA Vecteur Séquençage Extraction tags, ligation, clonage 3 2 1 1 Extrémités 3’ des ARNm • Les tags font entre 10 et 15 pb. Probabilité est de 410 (1 chance sur 1 million) et 415 (1 chance sur 1 milliard) si les bases sont distribuées au hasard dans les séquences • 1 séquençage permet de lire environ 500 à 600 bases ce qui correspond à 40-60 tags (donc 40- 60 molécules d’ARNm) AAAAAA Synthèse ADNc Amorce oligodT biotinylée AAAAAA T TT TTT Coupure par Enzyme d’Ancrage (NlaIII) Reconnaissance 4 bases (1 coupure toutes les 256 pb en moyenne = 44) T TT TTT AAAAAA GTAC GTAC Purification sur billes de streptavidine T TT TTT GTAC AAAAAA Fragments 3’ de tous les ARNm présents Dans l’échantillons GTAC biotine Population représentative des ARNm présents dans l’échantillons de départ CCCTGTAC T TT TTT GTAC AAAAAA 50% 50% Ligation linkers A et B T TT TTT CCCTGTAC AAAAAA T TT TTT AAAAAA GGGACATG B CCCTGTAC GGGACATG A Site reconnaissance TE (enz restric type II) 5pb. Coupure 13 pb après site reconnaissance BsmFI: GGGAC GGGACATG A NNNNNNNNNN NNNNNNN CCCTGTACZZZZZZZ B GGGACATGZZZZZZZZZZ Population de fragments représentative des parties 3’ de tous les ARNm présents dans l’échantillons de départ Population A Population B 13 10 Site reco BsmF1 CCCTGTAC A NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN GGGACATG CCCTGTACZZZZZZZZZZ B GGGACATGZZZZZZZZZZ Ligation CCCTGTAC A NNNNNNNNNN GGGACATG NNNNNNNNNN ZZZZZZZZZZ ZZZZZZZZZZ GTACAGGG B CATGTCCC Création bords francs T4 DNA pol PCR amorces A et B CCCTGTAC A VVVVVVVVVV GGGACATG VVVVVVVVVV YYYYYYYYYY YYYYYYYYYY GTACAGGG A CATGTCCC CCCTGTAC B KKKKKKKKKK GGGACATG KKKKKKKKKK SSSSSSSSSS SSSSSSSSSS GTACAGGG B CATGTCCC CCCTGTAC GGGACATG A NNNNNNNNNN NNNNNNN CCCTGTACZZZZZZZZ B GGGACATGZZZZZZZZZZ Population ditags type AB majoritaire (AA et BB donnent des « hairpins » lors PCR) 13 10 CCCTGTAC A NNNNNNNNNN GGGACATG NNNNNNNNNN ZZZZZZZZZZ ZZZZZZZZZZ GTACAGGG B CATGTCCC Coupure AE Purification ditags NNNNNNNNNN ZZZZZZZZZZ NNNNNNNNNN ZZZZZZZZZZ GTAC CATG Ligation Clonage NNNNNNNNNN ZZZZZZZZZZ GTAC CATG WWWWWWWWWW YYYYYYYYYY GTAC CATG…… ZZZZZZZZZZ YYYYYYYYYY NNNNNNNNNN WWWWWWWWWW GTAC…… CATG Population de ditags purifiés Séquençage Analyse bioinformatique CCCTGTAC A NNNNNNNNNN GGGACATG NNNNNNNNNN ZZZZZZZZZZ ZZZZZZZZZZ GTACAGGG B CATGTCCC 20 pb Tag A Tag B Avantages et inconvénients la technique SAGE • Permet une quantification absolue des ARNm (contrairement aux puces à ADN où la quantification est relative) • Ne nécessite pas d’investissements lourds • Technique compliquée et difficile à maîtriser • Assez peu reproductible (pour un même échantillon, les résultats peuvent être significativement différents) • Ce n’est pas une technique exhaustive (on peut « louper » des gènes) • Un même gène peut donner des tags différents (si polyadénylation différentielle) • Théorie: ditags = 10+10. En réalité, cela peut être 9+11, 8+12 car TE ne coupe pas à 100% à position +10. Pb pour identifier ensuite les transcrits!!!! Nombre de clones séquencés cycles Théorie expérimental Nombre de Tags identifiés artefacts Séquençage d’ESTs • Expressed sequence tag. Séquençage systématique de tous les clones d’ADNc d’une banque • Biais liés à la sous-représentation de certains gènes (absence des transcrits les moins abondants) • Coûteux mais très informatif • Base de travail pour l’utilisation d’autres méthodes d’étude du transcriptome (ex: macro- ou microarrays) chez des espèces dont le génome n’a pas été séquencé (plantes d’intérêt agronomique par exemple) La DD RT-PCR • DDRT-PCR : Differential Display Reverse Transcription - Polymerisation Chain Reaction • Technique basée sur la RT-PCR • Différences d’expression de gènes entre 2 cellules dans des conditions différentes • Technique de tri d’ARNm : differential display La technique de Differential Display Reverse Transcription PCR DDRT-PCR Principe de la technique • Synthèse d’ADNc à partir d’une population d’ARNm en utilisant des amorces ancrées oligo dT dont l’extrémité 3’ est A, T, G ou C • Amplification PCR des ADNc en utilisant ces mêmes amorces oligo dT (amorces inverses complémentaires) et des amorces directes aléatoires (10-mers) • Séparation des produits de PCR sur gel de séquence (acrylamide) et comparaison des profils obtenus avec un même couple d’amorce pour différents échantillons biologiques • Clonage et identification des bandes d’intérêt Etape 1: synthèse des 4 populations d’ADNC AAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAA 1 population ARNm RT 1 RT 2 RT 3 RT 4 ATTTTTTTTTTTTT GTTTTTTTTTTTTT CTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTT 4 populations ADNc Etape 2: PCR a partir des 4 populations d’ADNC Exemple avec la population obtenue avec ATTTTTTTTTTTTT ATTTTTTTTTTTTT TAAAAAAAAAAAA TAAAAAAAAAAAA Messager type X Messager type Y ATTTTTTTTTTTTT 5’ 5’ 5’ 5’ PCR avec amorces directes aléatoires (N10) et inverses complémentaires ATTTTTTTTTTTTT ATTTTTTTTTTTTT ATTTTTTTTTTTTT Amplifiats correspondant à l’ARNm X Amplifiats correspondant à l’ARNm Y La uploads/Philosophie/ courstranscriptome-1-introsage.pdf