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UNIVERSITE D’ALGER Faculté de Médecine et de Médecine Dentaire ZIANIA (Château

UNIVERSITE D’ALGER Faculté de Médecine et de Médecine Dentaire ZIANIA (Château Neuf) COURS DE GENETIQUE 1ére année -2014-2015- LE GÉNIE GÉNÉTIQUE ET LA BIOLOGIE MOLÉCULAIRE UNIVERSITE D’ALGER Faculté de Médecine et de Médecine Dentaire ZIANIA (Château Neuf) COURS DE GENETIQUE 1ére année -2014-2015- Plan Introduction I - Qu’est ce Que le génie génétique ? II - Quels sont les outils du génie génétique ? II.1- Les Enzymes II.1.1- Enzymes de restriction II.1.2- ADN polymérases II.1.3- Les ligases II.2 - Les vecteurs II.2.1- Vecteur de clonage II.2.2 - Vecteur d'expression II-3 Les sondes moléculaires III- Quelles sont les techniques du génie génétique ? III-1 Technique d’électrophorèse sur gel d’agarose III-2 Technique de PCR III-3 Technique de séquençage III-4 Technique de Southern blot IV-Applications IV-1 Diagnostic génétique IV-2 Thérapie génique IV-3 Synthèse de molécules thérapeutiques UNIVERSITE D’ALGER Faculté de Médecine et de Médecine Dentaire ZIANIA (Château Neuf) COURS DE GENETIQUE 1ére année -2014-2015- Introduction Depuis, la découverte dans les années 1950 du rôle de l'ADN et des gènes qu'il contient, l’homme a saisi l’intérêt qu’il pouvait tirer de modifications des informations portées par cette molécule de vie. Il devenait possible d’enlever un gène d’une cellule d’une espèce et de l’insérer dans une cellule d’une autre espèce, ce qui a donné naissance à une discipline appliquée: le génie génétique. Celui-ci est devenu un champ très actif de la recherche car les applications possibles sont multiples, et très variés, notamment en santé humaine (diagnostic médical), en industrie pharmaceutique, en agriculture, en industrie chimique et en environnement. Les scientifiques peuvent faire des manipulations génétiques en utilisant la technologie de recombinaison de l'ADN. Les méthodes de la biologie moléculaire sont essentiellement basées sur l’hybridation entre les bases purique (A et G) et pyrimidiques (C, T et U) La contribution de la biologie moléculaire est considérable.  Connaissance de la physiologie moléculaire ; contenu de la cellule.  Détermination des séquences des gènes;  Connaissance sur les mécanismes de régulation de l’expression des gènes ;  La pathologie moléculaire ;  Diagnostic des maladies héréditaires ;  Elle contribue au conseil génétique ; La biologie moléculaire possède également des applications en médecine légale comme :  La reconnaissance des personnes lors des grandes catastrophes,  La reconnaissance de paternité,  La reconnaissance des individus en criminologie, Mis en œuvre de l'empreinte génétique permettant d'identifier sans erreur un individu à partir d'un échantillon de son ADN, Les matériaux qui sont typiquement recherchés sont le sang, les poils et plumes, la salive, les excréments, des échantillons de peau ou de mucus ainsi que d’autres types de tissus. La principale méthode utilisée pour analyser ces matériaux est l’analyse d’ADN. I - Qu’est ce que le génie génétique ? Le génie génétique est fondé sur un ensemble de techniques et de différents procédés permettant notamment d'isoler un ou plusieurs gènes d’un organisme, de l'observer, l’étudier, le manipuler, le cloner, l’amplifier, de le couper et épisser des séquences identifiables d'ADN. Le gène peut aussi être modifié et /ou réimplanté éventuellement dans un autre organisme afin de modifier leurs propriétés biologiques (modification des génotypes, et donc des phénotypes). Pour pratiquer une chirurgie des génomes précise et sûre, les scientifiques se sont donc tournés vers des outils plus précis et des techniques plus performantes. II - Quels sont les outils du génie génétique? II.1- les Enzymes : II-1.1- Enzymes de restriction : molécules extraites à partir de microorganismes (généralement des bactéries) et qui coupent les liaisons phosphodiesters au niveau des acides nucléiques. Les enzymes de restriction permettent de couper l’ADN dans des endroits bien précis a - Les exonucléases : Elles digèrent l'ADN à partir de l'extrémité 5' ou 3'. b - Les endonucléases : Elles coupent l'ADN à l'intérieur en cassant les liaisons phosphodiester. Les endonucléases coupent au niveau de sites spécifiques appelés « sites de restrictions », ces sites sont de nature palindromique, c'est-à-dire la lecture des deux brins complémentaires dans des sens opposés donne la même séquence. (Fig.1) UNIVERSITE D’ALGER Faculté de Médecine et de Médecine Dentaire ZIANIA (Château Neuf) COURS DE GENETIQUE 1ére année -2014-2015- Figure 1 : séquence palindromique Il y a deux catégories d'endo-nucléases : celles qui donnent des extrémités franches et celles qui donnent des extrémités cohésives, d’où la possibilité de lier des fragments d’ADN d’origine différentes : c’est le phénomène de la recombinaison génétique. - Extrémités franches : la coupure d’une molécule d’ADN peut se faire au milieu du palindrome - Extrémités cohésives (adhésives)/ bouts collants : d’autres types d’enzymes agissent en coupant de part et d’autre du centre de symétrie (Fig.2). Figure 2 : les deux types d’endonucléases Tableau 1: exemple de quelques endo nucléase et leurs origines Sens de lecture 5’ ATGCTAGATAGCAT 3’ 3’ TACGATCAATCGTA 5’ Sens de lecture Les enzymes de restriction couramment utilisées en biologie moléculaire pour couper l’ADN interagissent avec des séquences constituées de 1 à 10 nucléotides. Ces séquences, très courtes et souvent palindromiques, sont généralement présentes à plusieurs endroits du génome. Les enzymes de restriction sont donc susceptibles de couper la molécule d’ADN à de multiples reprises. Remarque Il existe trois types d’enzymes de restriction. Les enzymes de type I et III ne sont pas utilisées en pratique, car elles coupent l’ADN de façon aléatoire. Les enzymes de restriction de type II, clivent spécifiquement les deux brins d’ADN au niveau d’une séquence bien définie. Elles ont la particularité de reconnaitre et de couper des séquences palindromiques UNIVERSITE D’ALGER Faculté de Médecine et de Médecine Dentaire ZIANIA (Château Neuf) COURS DE GENETIQUE 1ére année -2014-2015- II.1.2 ADN polymérases Elles réalisent des liaisons phosphodiester entre deux nucléotides adjacents. a- Fragment de Klenow : extrait à partir de la bactérie E. coli, active à 37°C, utilisé pour marquer des molécules d'ADN . Il est obtenu par digestion enzymatique de la polymérase I d’E. coli. Ce fragment conserve l’activité polymérase et exo-nucléase 3’5’ et perd l’activité exo-nucléase 5’3’. Le fragment de Klenow permet le séquençage de l’ADN, selon la méthode de Sanger : la synthèse de second brin d’un ADN complémentaire et le marquage isotopique au P32 de l’extrémité 3’ de l’ADN par échange de nucléotides froids contre des nucléotides marqués au P32. (fig.3). 1 324 928 Figure 3 : fragment de Klenow b- Taq polymérase : extraite à partir d’une bactérie Thermus aquaticus, active à 70°C, utilisée dans la technique PCR, en vue d’une amplification de l'ADN in vitro. II.1.3 Les ligases Elles réalisent des liaisons phosphodiester, pour souder deux segments d'ADN. (Fig.4) II.2- Les vecteurs Ce sont des molécules d’ADN construites à partir de plasmides ou de virus (cosmides), qui permettent le transfert de gènes entre cellules. Tous les vecteurs possèdent un polylinker renfermant plusieurs sites de restriction, où on peut ouvrir le vecteur pour insérer une séquence d’ADN et un gène de résistance aux antibiotiques. Le gène de résistance permet de sélectionner les cellules qui ont reçu le vecteur après transfection. Il existe deux grandes catégories de vecteurs : II.2.1 Vecteur de clonage : renferme une origine de réplication (Ori V), il permet de cloner un segment d'ADN ou un gène qui y est intégré (Figure 5) II.2.2 Vecteur d'expression : renferme un promoteur, il permet de faire exprimer un gène (Figure 6) 5’  3’ Exonucléase 3’  5’ Exonucléase Polymérase Trypsin subtillis inn N C 34000 Petits fragments 76000 Grands fragments (fragments de Klenow) Figure 4 : réalisation de liaisons phosphodiester par la ligase UNIVERSITE D’ALGER Faculté de Médecine et de Médecine Dentaire ZIANIA (Château Neuf) COURS DE GENETIQUE 1ére année -2014-2015- II.3- Les sondes moléculaires : Ce sont des séquences d'ADN monocaténaires, marquées, complémentaires du gène recherché, leur rôle est la détection de gènes, notamment en diagnostic génétique. Le principe consiste à détecter la présence d’une mutation ponctuelle en réalisant l’hybridation moléculaire entre la séquence à tester et la sonde de l’allèle muté, l’utilisation d’une sonde spécifique de l’allèle normal est nécessaire pour réaliser un témoin négatif. Pour s’hybrider de façon spécifique à la séquence complémentaire, la sonde doit être courte. Les sondes sont marquées avec un élément radioactif (P32) ou chimioluminescent (digoxygénine) pour pouvoir les détecter après hybridation. Les sondes permettent de détecter des séquences uniques de génome, il est ensuite possible d’amplifier une séquence de gène présente en un nombre limité d’exemplaires dans l’échantillon. III- Quelles sont les techniques du génie génétique? III-1- Technique d’électrophorèse sur gel d’agarose : L’ADN génomique est fragmenté par une enzyme de restriction. Le produit de la digestion est ensuite migré sur le gel d’agarose par électrophorèse afin de séparer les fragments de restriction en fonction de leurs poids moléculaires (Figure 7) : III-2-Technique PCR : (Polymerase Chain Reaction) La polymérisation en chaîne permet d’amplifier de courtes séquences d’ADN (quelques kilobases) in vitro, à partir d’une très petite quantité d’ADN même issue d’une seule cellule, par une série de cycles se déroulant en trois étapes : dénaturation, hybridation de l’amorce, réplication. Le nombre de molécule obtenu après n cycles est 2n. (Figure 8) - Dénaturation : l’ADN à amplifier est dénaturé à la chaleur, les deux brins se séparent et uploads/Sante/ cours-genie-genetique.pdf