Remerciez-le!

Remerciez @Admin pour avoir partagé cet document gratuitement, de la manière la plus simple, en partageant sur les réseaux sociaux.

 Matériels  Appareillage : -Agitateur magnétique -Bain marie agitateur -Centr

 Matériels  Appareillage : -Agitateur magnétique -Bain marie agitateur -Centrifugeuse réfrigérée -Congélateur (-80°C et -20°C) -Etuve -Néphélemètre -PH mètre -Pipette électronique -Spectrophotomètre -Vortex  Les équipements : -Balance. -Chronomètre. -Cupules. -Embouts. -Eppendorfs. -Gants à usage unique. -Glace pilée. -Micropipettes réglables de 0,5 à 1000μl. -Portoirs. -Tubes coniques. -Tubes en verre et en plastique de 5ml.  La Verrerie : -Bécher. -Eprouvettes graduées de 1ml à 1000ml. -Erlenmeyer. -Pipettes pasteur. -Pissette. -Tube à essai. -Tube à visse.  Méthodes : 1- Recrutement des patients : Les patients ont été recrutés au niveau : du service de gastro-entérologie de l’hôpital Mohamed Lamine DEBAGHINE, et de l’hôpital Mustapha BACHA, service de néphrologie de l’hôpital Parnet, d’hémodialyse de Rouiba ainsi que le centre de transfusion sanguine de Ain-Taya ainsi qu’à l’institut pasteur. Après trois mois de recrutement, 70 échantillons sanguins de patients infectés par le virus de l’hépatite C avec en parallèle trente individus sains servant de temoin ont pu être récolté. Tous les participants de l’étude ont signé un consentement après avoir été informé du but de la recherche et du devenir des prélèvements. 2- Collecte du sang et séparation des plasmas et sérums : Le sang est récolté dans un tube Falcon et dans un tube sec. Les tubes Falcon contiennent de l’anticoagulant EDTA qui est un chélateur d’ions (Ca2+), afin d’empêcher l’inactivation spontanée du complément ; pour la technique du CH50. Les tubes sont maintenus à +4°C jusqu’à l’acheminement vers le laboratoire. Les tubes EDTA sont centrifugé à 2000 rpm pendant 10 minutes à +4°C, le plasma obtenu est aliquoté dans des Eppendorfs à l’aide d’une micropipette ; et stocké à -80°C afin de conserver l’activité du complément. Le sérum est récupéré à partir des tubes secs après décantations puis centrifugation à 2000 Rpm/min pendant 10min à +4°C, et conservé à -20°C. 3- Dosage du complexe hémolytique (CH50) :  Principe : Le test CH50 est un dosage hémolytique fonctionnel, qui consiste à utiliser des érythrocytes de mouton sensibilisés par des anticorps de lapin anti-érythrocytes (hémolysine). Le complexe immun formé active la voie classique du complément. On définit alors le CH50 comme la quantité de sérum donnant 50% d’hémolyse, et on l’exprime en pourcentage d’un témoin constitué d’un pool de sérums normaux qui est le plasma humain normal (PHN).  Mode opératoire : A-Préparation des globules rouges sensibilisés : -Des globules rouges de mouton (GRM) sont successivement lavés avec un tampon de lavage GVB-EDTA et centrifugé à 2000 Rpm/min 10minutes à +4°C. -Une suspension à 5% de ces GRM dans le même tampon est ensuite préparée (v/v). -La concentration des cellules est équilibrée à 109/ml, en ajustant la concentration de 100µl de ces derniers dans 2900 ml d’eau distillé sur une longueur d’onde de 541 nm pour une densité optique de 0,37. -La suspension est sensibilisé avec un volume de GVB-EDTA, en ajoutant 2V d’hémolysine (Ac de lapin anti-hématies de mouton) dans un bain marie agitateur pendant 30 minutes. -Des lavages des GRM sensibilisés sont effectués avec du GVB-EDTA puis du GVB++, qui est un tampon riche en Ca2+ et Mg2+, afin d’activé la voie classique du complément. -Le culot est resuspendu dans un volume de GVB++ égale au volume de la première suspension avec le GVB-EDTA. B-Dilution et répartition des plasmas : -Les plasmas des patients et le PHN sont dilués au 1/30ème, puis la série de dilution suivante est effectuée : Tube 1 Tube 2 Tube 3 Tube 4 Tube 5 Tube 6 Tube 7 T0 T100 BLANC GVB++ (µl) 400 350 300 250 200 150 100 450 450 450 Plasma dilué (µl) 50 100 150 200 250 300 350 0 0 300 EA (µl) 300 300 300 300 300 300 300 300 300 0 *T0= lyse spontanée des hématies *T100= lyse totale des hématies -Les dilutions sont ensuite déposés pendant 30 minutes dans le bain marie agitateur. -La réaction est stoppée avec 1,7 ml d’eau physiologique, sauf pour le T100 l’arrêt de la réaction se fait par l’eau distillée, afin d’avoir un maximum de lyse. -Après une centrifugation de 1500 Rpm/min, pendant 5minutes, on peut voir une dégradation de couleur a l’œil nue. Le pourcentage de lyse est exprimé en fonction de la quantité de sérum ajoutée qu’on mesure par lecture spectrophotométrique de la D.O à 541nm du surnageant et qui sera proportionnelle à la quantité d’hématies lysées. Calcul du titre du CH50 : -Une courbe avec en abscisse les concentrations du sérum et en ordonnée le pourcentage de lyse (Y) est tracée. Y = [(DO Echantillon - DO T0)/ (DO T100 - DO T0)] x 100 -La concentration donnant 50% d’hémolyse est extraite du graphe afin de calculer le titre du CH50 CH50 (Unités /ml) =1/ Volume de sérum donnant 50% d’hémolyse Figure : Schéma générale de la technique du CH50 4- Dosage des fractions C3 et C4 du complément par néphélémétrie:  Principe: Le dosage antigénique des protéines du complément C3 et C4 par la méthode immunochimique est basée sur l’immunoprécipitation en milieu liquide de complexes immuns afin de déterminer la concentration d’un Ag soluble. Un faisceau lumineux est dévié par les complexes immuns formés par les antigènes recherchés avec des anticorps monoclonaux spécifiques. La quantité de lumière difractée est proportionnelle à la quantité de protéine recherchée.  Mode opératoire: - Les sérums des patients sont dilués au 1/11éme avec un tampon de réaction. 40µl de la dilution est déposé dans une cuvette contenant un barreau magnétique. -La cupule est placée dans le néphélémétre. Puis à l’aide d’une pipette électronique on rajoute respectivement 400µl de tampon et 40µl d’anti sérum spécifique à la fraction recherchée (C3 ou C4). -La concentration de la fraction présente dans l’échantillon est alors indiquée sur l’appareil. Figure : Courbe représentant le dosage du CH50. (D’après Gorochov et Papo ; IMMUNOLOGIE, INTER MED) 5-Technique d’immunodiffusion radiale  Principe Le dosage par immunodiffusion radiale est appliqué pour la quantification d’Ac solubles dans les liquides biologiques. C’est une technique d’immunoprécipitation sur un milieu gélifié. Elle est basée sur la diffusion d’un Ag à partir d’un puits cylindrique creusé dans un gel d’agarose contenant des Ac spécifiques. Au cours de la diffusion, des anneaux de précipitations sont formés autour des puits correspondant à des complexes Ag-Ac. Au point final de diffusion une courbe de calibration linéaire est établie en reportant les diamètres carrées des annaux de précipitation en fonction de la concentration de chacun des 3 calibrateurs. À partir de la courbe de calibration, la concentration en Ag d’un échantillon sera directement obtenue par extrapolation du diamètre au carrée de l’anneau de diffusion. Figure : courbe de variation de la quantité de précipité en fonction du rapport Ag/Ac (D’après Audigié, Dupont et Zonszain, Principes des méthodes d’Analyse biochimique) A. Dosage de la protéine C1q : (ELISA, EUROIMMUN, Germany) Le dosage de C1q nécessite : -Des calibrateurs avec différentes concentrations (Haut, Moyen, Bas) et un contrôle lyophilisé, sont reconstitués avec un volume d’eau distillée. -Les sérums des patients et le contrôle sont dilués au ½ avec du BSA 7%. Après homogénéisation, 10µL de chaque composant est déposé dans un puits de la plaque IDR, contenant des Ac monospécifiques dirigés contre la protéine C1q. Au bout de 96 heures d’incubation à 20°C, les diamètres des anneaux de diffusion sont mesurés, et à partir de la courbe de calibration établie, la concentration de C1q pour chaque patient est extrapolée. B. Dosage du Facteur B : (ELISA, EUROIMMUN, Germany) -Un calibrateur lyophilisé est reconstitué avec de l’eau distillé. Ce dernier est dilué à 60% et à 10% avec du BSA7% afin d’obtenir 3 calibrateurs : pure (haut), diluer à 60 %(moyen) à 10% (bas). Figure : Courbe de calibration linéaire des diamètres au carrées des calibrateurs en fonction de leurs concentrations. (D’après Gene Mayer; IMMUNOGLOBULINS- ANTIGEN-ANTIBODY REACTIONS AND SELECTED TESTS). -Les sérums des patients ne nécessitent pas de dilution. 5µl de chaque composant est alors déposé dans un puits, de la plaque IDR, contenant des Ac monospécifiques dirigés contre le facteur B. Au bout de 72 heures d’incubation à 20°C, après avoir établie une courbe de calibration linéaire, la concentration en Facteur B de chaque échantillon est alors obtenue après mesure des diamètres. 5- Extraction de l’ADN par la méthode phénol chloroforme  Principe Cette méthode consiste à extraire les acides nucléiques à partir du sang total prélevé dans un anticoagulant, en utilisant le couple phénol/chloroforme .Dans un premier temps le culot leucocytaire est préparé, en éliminant les globules rouges par une solution de lyse. Puis dans un deuxième temps la libération de l’ADN des leucocytes dans le milieu, et la digestion des protéines qui lui étaient associées. Cette technique nécessite l’extraction phénolique qui est basée sur la solubilité différentielle des acides nucléiques entre deux phases non miscibles, et l’extraction chloroformique qui complète l’action du phénol en dénaturant les protéines insolubles et en séparant la phase aqueuse de la phase organique.  Mode opératoire A- Lyse des globules rouges Dans un tube Falcon, 45ml de la solution de lyse des globules rouges (SLR) est ajoutée à 10ml du uploads/Sante/ materiels-et-methodes-hcv.pdf