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Diagnostic bactériologique de la tuberculose Nouvelles méthodes Dr H. AMMARI La

Diagnostic bactériologique de la tuberculose Nouvelles méthodes Dr H. AMMARI Laboratoire Central de Biologie médicale CHU Béni-Messous 02/10/2018 Introduction • Tuberculose: fréquente en Algérie • Importance du diagnostic bactériologique (microscopie et/ou culture) • Délais de la culture longs • Intérêt des nouvelles techniques de diagnostic de la tuberculose Les prélèvements La mise en évidence du bacille tuberculeux en microscopie et en culture reste le critère essentiel du diagnostic de la tuberculose qu'elle soit pulmonaire ou extra-pulmonaire. 1 - Les prélèvements : 2 types de prélèvements a - prélèvements d'origine pulmonaire • Les crachats • Le tubage gastrique • Lavage bronchique ou aspiration bronchique • Ecouvillonnage laryngé Les prélèvements b- prélèvements d'origine extra- pulmonaire : divisés en 2 catégories • Contaminés : ils proviennent de collections purulentes s'écoulant à l'extérieur et dont la souillure est inévitable malgré les précautions aseptiques prises lors du prélèvement (urines, pus d'abcès fistulisés, autres produits pathologiques pris sans précaution d'asepsie. • Non contaminés : ce sont les liquides séreux ou séro- purulents se trouvant dans les cavités fermées. Ils sont recueillis par ponction après désinfection de la peau. Il s'agit essentiellement des liquides de ponction (LCR, liquide pleural, liquide péritonéal, liquide d'épanchement articulaire…) et des biopsies chirurgicales. Prélèvements 2 - La fiche de renseignements : ++++ 3 - Transport et conservation : Conservation au réfrigérateur (+4°C)en attendant le transport. Transport dans une boîte réservée à cet effet, les crachoirs et autres tubes hermétiquement fermés et soigneusement étiquetés. Conduite à tenir au laboratoire Diagnostic bactériologique - Examen macroscopique : examen important surtout pour les crachats ils doivent être muco-purulents ou hémorragiques. Les crachats spumeux (salivaires) ne sont pas analysés (prélèvements non conformes). - La quantité est importante à noter; les prélèvements contaminés dont la quantité <2 ml ne sont pas mis en culture. Examen microscopique • Etape clé: permet de dépister les formes les (+) contagieuses (OMS). • Colorations : la méthode de ZIEHL-NEELSEN ou la méthode en fluorescence. • Lecture et résultats standardisés en fonction de la richesse des lames en BAAR (intérêt diagnostic et thérapeutique). La culture • Les prélèvements non contaminés sont ensemencés directement ou après centrifugation stérile, sur plusieurs tubes de culture de milieu de Lowenstein-Jensen. • Les prélèvements contaminés doivent être décontaminés avant leur mise en culture. • Les milieux ensemencés sont incubés à 35-37°C. • Lecture au 28ème, 42ème et 72ème jour: une première lecture est faite à 48h. • Si la culture est positive, on compte le nombre de colonies par tube et on donne un résultat quantitatif. • Parfois, les colonies sont confluentes et forment un tapis uniforme sur la totalité de la surface du tube; on répond dans ce cas: culture en nappe ou (+++). Cultures positives à partir du 28ème jour d’incubation à 37°C Culture (2) – Méthode MGIT (Mycobacterial Growth Indicator Tube) BACTEC 960: culture en milieu liquide automatisée Principe: émission de fluorescence sous l’effet de la baisse de la tension de l’oxygène dans le tube de culture spécifique contenant un indicateur fluorescent Technique: - Simple • Résultats disponibles en 5 à 20 jours (8 jours) (4-6 sem en milieu solide) • Gain de sensibilité > 10% • Permet l’étude de la sensibilité aux antituberculeux (14 jours) • Mais coût encore élevé (matériel) et milieux Intérêts de la culture • Plus sensible que les techniques microscopiques: permet le diagnostic des tuberculoses à microscopie négative (TEP sont paucibacillaires) • Permet l'identification de la mycobactérie en cause grâce à l'étude des caractères biochimiques. • Permet de pratiquer les antibiogrammes et donc d'étudier la sensibilité de M. tuberculosis aux antituberculeux. Méthodes de diagnostic rapide Méthodes de biologie moléculaire L'amplification d'ADN par PCR (Polymerase Chain Reaction) - Principe: La technique PCR permet d'amplifier une séquence d'ADN particulière en un nombre de copies suffisant pour en assurer la détection. - Méthode rapide (quelques heures). - Sensible puisque l'ADN de M.tuberculosis peut être détecté alors que < 10 bacilles sont présents dans le prélèvement initial (en théorie). - Contraintes de la technique et le coût important de cette technique en font réserver les indications aux cas de diagnostic difficile ou urgent (immunodéprimés, nouveau- nés, formes méningées ou pleurales), le plus souvent du ressort de centres spécialisés. Méthodes de biologie moléculaire • Soit directement à partir de l’échantillon clinique, soit à partir de la culture. • Les techniques de PCR sont rapides et sensibles mais un résultat (-) n’exclut pas une infection. • Tests moléculaires pour déceler les résistances à la Rif et à l’INH (et récemment anti-tbk de 2ème ligne). • Tests moléculaires pour l’identification rapide des espèces au sein du complexe M. tuberculosis. La technique PCR GeneXpert® • PCR • Détection des mycobactéries du complexe tuberculosis • Détection de la Rce à la Rif (AntiTB majeur: Synonyme de Multirésistance) • Test unitaire, sécurisé, automatisé, facile à utiliser, rapide et fiable • Permet le Dc de la tbc avec une sensibilité variable en fonction de l’origine des pvts et de la charge bactérienne. La technique PCR GeneXpert® La technique PCR GeneXpert® Tests basés sur la production d’INF-γ en réponse à des antigènes spécifiques de M. tuberculosis • Nouveaux tests palliant les limites du test cutané tuberculinique • Test sanguin réalisé in vitro, mesurant la production d’INF-γ après stimulation des lymphocytes/Ag spécifiques de M.tuberculosis • 2 tests commercialisés: T-SPOT. TB (UK)et le QuantiFÉRON- TB Gold (Australie) • Avantage: spécifiques (indépendants de la vaccination par le BCG) • Inconvénient: ne fait pas la distinction entre tuberculose latente et tuberculose active • Non utilisé chez le jeune enfant • Bonne valeur prédictive négative Conclusion • La positivité de l’ex. microscopique permet d’accélérer le Dc • La culture reste le gold standard du Dc de la tuberculose • Il faut réunir les conditions pour qu’ils soient positifs (qualité du prélèvement+++) • La confirmation Dc des tuberculoses paucibacillaires reste difficile malgré les nouvelles techniques. uploads/Sante/ nouvelle-recomendation.pdf