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LE SERODIAGNOSTIC DE LA SYPHILIS VDRL - TPHA Elaboré par : YASMERO 2O14 PLAN DE

LE SERODIAGNOSTIC DE LA SYPHILIS VDRL - TPHA Elaboré par : YASMERO 2O14 PLAN DE TRAVAIL Introduction I. Définition de la syphilis II. Les symptômes et les phases d’évolution de la syphilis III. Les réactions de la sérologie IV. L’interprétation des résultats Conclusion 1 Introduction 1 Le diagnostic sérologique repose sur la mise en évidence des anticorps induits par l’infection et retrouvés dans le sérum, celui-ci est traité pour retirer certaines substances qui peuvent gêner la technique ce qui aboutit à une certaine dilution Le patient doit être de préférence à jeun. I. Définition de la syphilis 2 La syphilis est une maladie infectieuse relativement fréquente. En recrudescence, elle se trouve au 3ème rang après les candidoses et les chlamydioses. Causée par un spirochète, le tréponème pâle (Treponema pallidum). La syphilis se transmet par les rapports sexuels, par voie transplacentaire ou exceptionnellement par contacts sanguins (piqûre, transfusion). Le sérodiagnostic de la syphilis est un examen consistant à rechercher dans le sang des anticorps spécifiques à la maladie. Celui-ci permettra de déterminer le stade de l'infection. II. Les symptômes et les phases d’évolution de la syphilis : 3, 4 La syphilis évolue en 3 phases sur plusieurs mois (voire plusieurs années), entrecoupées de phases asymptomatiques pendant lesquelles seul le diagnostic sérologique est possible. Quant à La période d’incubation (temps entre le contact et l’apparition des symptômes), celle-ci varie habituellement entre 10 et 90 jours. Les symptômes peuvent passer inaperçus ou être mal reconnus, et peuvent même ne pas se manifester du tout. Mais lorsqu’ils sont présents, les symptômes se manifestent en trois stades: Stade primaire Trois à quatre semaines après le contact, un chancre (ulcère très superficiel, à bords réguliers, dont la base est enflée et qui peut mesurer jusqu’à 1 cm de diamètre) apparaît au site d’entrée du microbe (bouche, pénis, vagin ou anus). Le chancre ne cause généralement pas de douleur et peut être associé 1 Otto Braun-Falco, Dermatology, 2000, 282 p. 2 ADAM WYNTER, the Rosen Publishing Group, 2007, 64 p. 3 Didier Bessis, ‎ C. Francès, ‎ B. Guillot, Manifestations dermatologiques des maladies infectieuses métaboliques et toxiques, 2009 4 Michel Vaubourdolle, infectiologie 3eme ed. 2007, 334p. 2 à des ganglions (petites bosses non douloureuses). C’est par contact direct avec ce chancre que l’infection se transmet. La guérison du chancre se produit spontanément (sans traitement) en 3 à 8 semaines. Cependant, l'individu reste contagieux et le test sanguin de dépistage est souvent négatif à ce stade. Stade secondaire Non traitée, la syphilis évolue et quelques semaines (de six semaines à six mois) plus tard, des rougeurs apparaissent sur la peau et les muqueuses, accompagnées de fièvre, de fatigue, de maux de tête et de douleurs musculaires. Ces symptômes disparaissent d'eux-mêmes sans traitement. La syphilis passe alors dans une phase de latence. C’est une période dite « silencieuse » pendant laquelle l’infection évolue sans manifestation aucune. Seul un test de sang peut révéler la présence du microbe. La personne demeure contagieuse. Le test sanguin sera généralement positif à ce stade, mais peut être faussement négatif chez les individus infectés par le VIH. Stade tertiaire Après plusieurs années, parfois 10 à 30 ans, des complications sérieuses peuvent affecter la peau, les os, ainsi que les organes vitaux tels que le système nerveux et le système cardio-vasculaire. III. Les réactions sérologiques : A - Réaction à antigène non tréponémique : VDRL (Veneral Disease Research Laboratory) Principe du VDRL :  Réaction d’agglutination passive sur lame en verre.  L’antigène utilisé est d’origine cardiolipidique constitué de microcristaux de cholestérol sur lesquels sont adsorbés les molécules de cardiolipide = Haptène de Wasserman.  Des particules de charbon sont piégées dans la combinaison Ac-Ag pour faciliter la lecture.  Résultat du dépistage est rendu positif ou négatif.  Résultat est rendu en titre en cas de dépistage positif Selon l’origine de l’antigène utilisé Réaction à antigène non tréponémique (Ag cardiologique) Réaction à antigène tréponémique 3 Technique du VDRL : Eléments de la réaction :  Sérum frais.  Eau physiologique.  Antigène VDRL près à l’emploi. Matériel:  Centrifugeuse  Micropipettes réglables (5-50µL)  Plaques en verre  Portoir pour tubes à hémolyse  Agitateur rotatif de Kline  Container de déchets contaminés  Eau de Javel Mode opératoire : a. La réaction qualitative  Distribuer 50µL de sérum sur chaque puits de la plaque en verre.  Ajouter 16 µL d’Antigène VDRL  Placer la plaque sur l’agitateur de Kline pendant 8 mn  Lire immédiatement au microscope Deux types de réactions Réaction qualitative (Dépistage) Réaction quantitative (Dépistage Positif) 4 a. 1. Manipulations pour le test qualitatif PUITS Témoin + Témoin - Témoins Ag VDRL Sérum inconnu Sérum 50 µL du sérum + 50 µL du sérum - 50 µL d’eau physiologique 50 µL du sérum inconnu Antigène VDRL 16 µL 16 µL 16 µL 16 µL Placer sur un plateau rotatif (agitateur de kline) pendant 8 mn Lecture + - - a. 2. Lecture du VDRL b. La réaction quantitative :  Lorsque la réaction quantitative est positive on réalise la même réaction avec une série de dilution du sérum au (1/2, ¼, 1/8, 1/16, 1/32) avec de l’eau physiologique.  Le titre d’anticorps est exprimé par l’inverse de la dernière dilution donnant une réaction positive nette. 5 b. 1. Manipulations pour le test quantitatif PUITS 1 2 3 4 5 Eau physiologique 50 µL 50 µL 50 µL 50 µL 50 µL Dilution 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 Sérum à analyser en µL 50 µL Reporter 50 Reporter 50 µL Reporter 50 µL Reporter 50 µL Jeter 50 µL dans l’eau de Javel Ag VDRL 16 µL 16 µL 16 µL 16 µL 16 µL Agitation pendant 8 mn Lecture B - Réaction à antigène tréponémique : TPHA (Treponema Pallidum Hemagglutination Assay) Principe du TPHA :  Réaction d’hemmagglutination passive réalisée sur des microplaques.  L’Antigène utilisé est un lysat de tréponema pallidum adsorbé sur des hématies.  Le dépistage consiste à tester le sérum à la dilution de 1/80.  Des dilutions sont effectuées pour le titre dans le cas du dépistage positif. Technique du TPHA : Eléments de la réaction :  Sérum frais.  Coffret de réactif près à l’emploi. Matériel :  Centrifugeuse  Micropipettes réglables (5-50µL), (50 – 200 µL)  Pipette multicanaux  Plaques de microtitration à fond en U  Cônes pour micropipettes  Portoir pour tubes à hémolyse  Container de déchets contaminés  Eau de Javel 6 Mode opératoire : a. La réaction qualitative  Distribuer le diluant dans les puits de microtitration comme suit dans le 1er, 3ème, et 4 ème puits mettez 25 µL, dans le 2ème puits mettez 100 µL.  Ajouter 25 µL du sérum à tester dans le puits numéro 1.  Diluer l’échantillon 1/20.  Ajouter 75 µL de la suspension d’HNS au puits 3, et le même volume de suspension d’HS au puits 4  La dilution finale des puits 3 et 4 est 1/80.  Couvrir la microplaque et laisser reposer pendant 45 à 60 min.  Effectuer la lecture à l’œil nu. a. 1. Manipulations pour le test qualitatif Deux types de réactions Réaction qualitative (Dépistage) Réaction quantitative (Dépistage Positif) 3ème puits 1er puits 2ème puits 4ème puits 25 µL 25 µL 25 µL 25 µL 25 µL du diluant + 25 µL du sérum 100 µL du diluant 25 µL du diluant + 75 µL d’HS 25 µL du diluant + 75 µL d’HNS Schéma illustrant le mode opératoire du test TPHA 7 a. 2. Lecture du TPHA 1er Puits : voile uniforme couvrant tout le puits → Fortement positif. 2ème Puits: voile couvrant le 2/3 du puits → Moyennement positif. 3ème Puits: voile couvrant le 1/3 du puits → Faiblement positifs. 4ème Puits: Anneau très serré à bord nets (absence de voile) → Négatif. b. La réaction quantitative :  Lorsque la réaction qualitative est positive (1/80) on réalise une série de dilution du sérum (1/80, 1/160, 1/320, 1/640, 1/1280, 1/2560…)  Le titre d’anticorps est exprimé par l’inverse de la plus haute dilution donnant encore une réaction positive Cupule A B C D E F G H Tampon en µL 25 25 25 25 25 25 25 Sérum 1/20 en µL 25 25* * * * * * ** HS en µL 75 75 75 75 75 75 75 75 Dilution 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 1/2560 1/5120 1/10240 Lecture + + + + + - - - Titre retenu 1280 ( dernière cupule présentant une hémagglutination nette ). * : reporter 25 µl dans la cupule suivante à gauche. **: jeter 25 µl dans l'eau de javel Sérum n°1 Sérum n°1 8 IV. L’interprétation des résultats : VDRL TPHA Diagnostic Examens complémentaires - - Syphilis exclue ou contamination très récente Refaire une sérologie 10 à 15 jours plus tard + + Forte probabilité de syphilis Situer le stade de l’infection par une sérologie quantitative - + Syphilis récente traitée ou ancienne (traitée ou non traitée) Une sérologie quantitative + uploads/Sante/ serodiagnostic-de-vdrl-et-tpha.pdf