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Intro : Les blots en général se sont des techniques de transfert d'ADN, d'ARN e

Intro : Les blots en général se sont des techniques de transfert d'ADN, d'ARN et de protéines sur un support de sorte qu'ils peuvent être séparé Par exemple : southern blot La définition Southern blot un méthode de biologie moléculaire a été initialement décrite par E.M. Southern en 1975. Elle consiste à détecter spécifiquement des fragments d'ADN transférés sur filtre par leur hybridation à des séquences complémentaires marquées par un radioisotope Le but de southern blot : permet de localiser une séquence d’ADN parmi les fragments ayant migrés, grâce à une sonde marquée. Elle permet de détecter une séquence d'ADN génomique dite unique le principe 1 Nous partons des fragments d'ADN obtenus par les enzymes de restriction. On va appliquer la technique du transfert de Southern pour fixer les sondes aux fragments leur correspondant ; une sonde étant un fragment d'ADN auquel on a marqué une base grâce à des composés radioactifs, fluorescents ou un anticorps qui sert à localiser une séquence de l'ADN qui nous intéresse. Le transfert de Southern sert donc à repérer des fragments d'ADN. D'une façon plus générale, ces fragments obtenus vont présenter des polymorphismes de restriction. Un polymorphisme de restriction est une variation individuelle de la séquence des bases du génome des eucaryotes modifiant un ou plusieurs sites de restriction. Donc, ces polymorphismes de restriction (mutations) vont, dans les faits, être intéressants pour déterminer des variations géniques, des tests de paternité par exemple. Le principe 2 : La clé de ce procédé est l'hybridation. Hybridation: Il est le processus de formation d'une molécule d'ADN double brin entre une sonde d'ADN simple brin et un ADN cible simple brin. Le protocole : Extraction de l’ ADN Restriction de l’ADN l’électrophorése Transfert Hybridation Autoradiographi Méthode : ADN génomique est d’abord fragmenté par une enzyme de restriction appropriée · Les fragments sont ensuite séparés par électrophorèse sur gel d’agarose, · L’ADN est dénaturé in situ par une solution de soude, · L’ADN dénaturé (simple brin) est transféré par capillarité sur un support solide (filtre de nitrocellulose ou nylon). Les membranes de nylon sont les plus utilisées car par un traitement au UV (254 nm), on forme des liaisons covalentes entre le DNA et le nylon de sorte que le support peut être utilisé plusieurs fois avec d’autres sondes. · Le support solide est hybridé avec une sonde mono-brin marquée à faible stringence puis lavé · Le ou les fragments reconnus par la sonde sont révélés par la technique de l’autoradiographie Résultat : La sonde va révéler la position sur la membrane des fragments d'ADN recherchés. Plusieurs situations peuvent se présenter :  Les fragments d'ADN sont semblables au lieu d'hybridation de la sonde et à proximité de celui-ci et les fragments sont de même taille : il n'y a pas de polymorphisme.  Un site de restriction au voisinage de la sonde n'est présent que chez l'un des deux individus ; les fragments n'ont pas la même taille et ne sont donc pas à la même hauteur sur le gel : il y a polymorphisme de sites de restriction.  Les sites de restriction sont identiques, mais une séquence supplémentaire est présente chez l'un des deux fragments. Les vitesses de migration des fragments et donc leur position sur le gel sont donc, ici aussi, différentes : il y a polymorphisme d'insertion/délétion Les champs de utilisation :  Pour identifier l'ADN spécifique dans un échantillon d'ADN  Pour isoler l'ADN désiré pour la construction d'ADNr  Identifier les mutations, délétions et des réarrangements de gènes  Utilisé dans le pronostic du cancer  Le diagnostic de VIH-1 et les maladies infectieuses uploads/Sante/ southern-blot.pdf