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TESTS IN VIVO ET IN VITRO ENCADRÉ PAR : PR KADDOUR PRÉSENTÉ PAR : DR DALI BRAHA

TESTS IN VIVO ET IN VITRO ENCADRÉ PAR : PR KADDOUR PRÉSENTÉ PAR : DR DALI BRAHAM 2018/2019 PLAN 1/ Introduction 2/ Définition 3/ Évolution de la toxicologie expérimentale 4/ Tests in vivo A. Études de la toxicité aigue B. Étude de la toxicité subchronique C. Études de la toxicité chronique 5/ Méthodes alternatives ( Test in vitro ) A. Méthodes alternatives de la toxicité local B. Méthodes alternatives de la Génotoxicité 6/ Méthodes in silico 7/ Toxicogénomique 8/ Stratégie des test intégrés 9/ Validation des méthodes alternatives Conclusion INTRODUCTION La prévention des éventuels effets néfastes liés à une exposition à un ou plusieurs agents chimiques, physiques ou biologiques présents dans notre environnement constitue un enjeu majeur de santé publique Pour évaluer ces effets, l'expérimentation animale occupe encore aujourd'hui une place centrale. Depuis quelques années, sous l'impulsion de la réglementation européenne, les études toxicologiques ont néanmoins tendance à laisser une plus large place aux méthodes alternatives 2/ DÉFINITION Toxicologie expérimental : Σ des essais Toxicologie expérimental : Σ des essais • Effets toxiques • Propriétés intrinsèques Les résultats de ces essais sont utilisés par les autorités pour évaluer un danger et un risque  Protéger la santé de la populations 4 étapes : • Identification du danger • Caractériser le danger (Établir la relation dose/ effet) • Évaluation de l’exposition • Évaluation du risque • La Toxicologie a du faire face à certain nombre de question : La prédictive des modèles animaux versus l’homme ? Problèmes éthique (règlementations) ? Représentativité, prédicitivité et validation des méthodes in vitro ? • Questions émergentes en toxicologie : Toxicologie de faible doses Relation dose repense non linaire Phénomène d’Hormèse Emergence de nouveau types de substances …….? Toxicologie qui s’adapte……….. Les tests sur les animaux sont interdites depuis 2013 ( UE ) pour les produits cosmétiques 3/ ÉVOLUTION DE LA TOXICOLOGIE EXPÉRIMENTAL • Réduire : Méthode statistiques système d’intégration Animaux transgéniques  « Omics » • Remplacer : in vitro (modèles cellulaires) in silico (modèles mathématiques) • Raffinement : l’imagerie Télémétrie 4/ TEST IN VIVO Définition : In vivo (en latin : « au sein du vivant ») C’est est une expression latine qualifiant des recherches ou des examens pratiqués sur un organisme vivant. A/ÉTUDES DE LA TOXICITÉ AIGUE • Etude qualitative et quantitative des phénomènes toxiques et de leur apparition dans le temps après administration unique de la substance ou d'une association de substances DL50 DL50 Test de tolérance oculaire Test de tolérance oculaire Tests de tolérance cutanée Tests de tolérance cutanée 1/ DL50 • La DL50 est une estimation statistique d’une dose unique de produit supposée tuer 50% d’un groupe d’animaux d’essai. • Elle est exprimée en mg de substance /kg de poids corporel. • Plus la DL50 est petite, plus le produit est toxique • Administration à différentes doses croissantes suffisantes pour obtenir un pourcentage de mortalité entre 0 % et 100 % Plus la DL 50 est petite plus la substance est toxique Plus la DL 50 est petite plus la substance est toxique G1 G2 G3 D1 D2 D3 D4……………………..D10 Voie d’exposition humaine Voie d’exposition humaine G10 G4 • plusieurs lots (10 lots) d'animaux d'expérience (10 animaux par lot, (rats/souris des deux sexes) 10 ♀♂ 10 ♀♂ 24h 2semaines 24h 2semaines • Observation de près durant les premières 24 h et ensuite quotidiennement pendant 2 semaines les éventuels changements de l'apparence et du comportement, ainsi que la létalité (DL50) observation observation 1/ DL50 • Déterminer une relation dose-repense • Classification des substances selon leur toxicité ; • Détermination de l’effet toxique spécifique, en fournissant des données pour déterminer les doses à utiliser pour les études à long terme ; • Évaluation du danger en cas de surdosage • Contrôle de qualité ; • Médicaments : calcul de l’index thérapeutique. INTÉRÊT DE LA DL50 Classes de toxicité : système général harmonisé Dose orale probablement mortelle catégorie < 5 mg/kg 1 Mortel en cas d’ingestion De 5 à 50 mg/kg 2 Mortel en cas d’ingestion De 50 à 300 mg/kg 3 Toxique en cas d’ingestion De 300 à 2 000 mg/kg 4 Nocif en cas d’ingestion De 2 000 à 5 000 mg/kg 5 Peut être nocif en cas d’ingestion 1/ DL50 Le test de la DL 50 est interdit depuis decembre 2002 , Remplacé par Méthode par classe de toxicité, ocde 423, 2001 Méthode de la dose prédterminée, ocde 420, 2001 Méthode de l’ajustement des doses, ocde 425, 2008 Le test de la DL50 a été officiellement abrogée en décembre 2002 par l'OCDE, l'Union Européenne et les États-Unis d'Amérique L’OCDE a élaboré les lignes directrices n° 420 (OCDE, 2001a), 423 (OCDE, 2001b), et 425 (OCDE, 2008b) qui décrivent des méthodes alternatives bien établies et validées qui réduisent les souffrances des animaux et/ou utilisent beaucoup moins d'animaux que la méthode classique de DL50  Principe : Il consiste à appliquer le produit à tester dans l'œil → mesurer le degré d'irritation Test de Draize  Test d’irritation oculaire  Test de toxicité aiguë qui utilise le lapin (peu de larmes  But : en est d'évaluer l'effet irritant ou corrosif de toute substance pouvant venir en contact avec les yeux 2/ Test de tolérance oculaire • Les réactions oculaires sont appréciées à l'œil nu ou à l'aide d'une fente lumineuse pendant 1, 2, 3, 4, et 7 jours après le traitement • Lésion cornéenne : surface d’opacification • Atteinte irienne : congestion et gonflement • Atteinte conjonctivale : rougeur et larmoiement • IO max < à 15 : faiblement I • IO max 15-30 : moyennement I • IO max 30-50 : irritant • IO max supérieur à 50 : très irritant Test interdit depuis la validation des M. Alternatives le produit(0,5ml ou 0,5 g) est appliqué de façon répétée sur les plaies peau de l'animal est rasée puis incisée les plaies sont recouvertes d’une compresse de gaze et maintenue pendant 4heures les plaies sont recouvertes d’une compresse de gaze et maintenue pendant 4heures On observe les réactions cutanées qui peuvent se produire 24, 48 ou après 72 heures inflammations ou des œdèmes Pas d’œdème 0 très léger œdème 1 léger œdème 2 œdème modéré 3 œdème sévère 4 Pas d’érythème 0 érythème léger 1 érythème bien visible 2 érythème modéré à sévère 3 érythème sévère -escarre légère 4 L’index d’irritation est obtenu selon l’équation: Score Erythème (24h+72h)/2+ score œdème (24h+72h)/2 A/ Test de Draize cutané 2/ Test de tolérance cutané objectifs : de mettre en évidence l’effet inflammatoire d’origine immunologique Réponses en 2 étapes : induction et déclenchement  hypersensibilité retardée B/ Test de sensibilisation cutanée •Deux méthodes de références chez le cobaye : basées sur la réponse au déclenchement Test de maximalisation de Kligman et Magnusson ( avec ajuvant GMPT) Test de Beuler (sans ajuvant ), • Deux méthodes alternatives ( chez les souris ) : basé sur les effets immunologiques provoqués par l’allergène pendant la phase d’induction Essais sur les ganglions lymphatiques locaux (LLNA) Essai de gonflement de l’oreille de la souris ( MEST) 2/ Test de tolérance cutané B/ÉTUDES DE TOXICITÉ SUBCHRONIQUE • La détermination de la toxicité subchronique par voie orale+++, cutanée et inhalée à doses répétées peut s'effectuer après avoir obtenu des informations préliminaires sur la toxicité à partir d'essais de toxicité aiguë • L'étude sur 90 jours fournira des informations sur: Les principaux effets toxiques ; Indiquera les organes cibles et les possibilités d'accumulation ; Une estimation de la Dose Sans Effet Toxique (NOAEL). • La méthode accorde davantage d'importance aux effets neurologiques et donne des indications relatives aux effets sur le système immunitaire et sur la reproduction. B/ÉTUDES DE TOXICITÉ SUBCHRONIQUE Principe : La méthode est basée sur l’administration répétée de la substance étudiée sur une période prolongée (un niveau de dose, quotidiennement, pendant 90 jours). • Ce test utilise principalement des rongeurs • Au moins 20 animaux (10 femelles et 10 mâles). • Trois concentrations, au moins,. • Les femelles doivent être nullipares et non gravides. • La dose la plus élevée doit être choisie en vue d'induire un effet toxique, mais pas la mort ni d'intenses souffrances C/ÉTUDES DE TOXICITÉ CHRONIQUE • Objectif : est de caractériser le profil d’une substance dans des espèces mammifères (essentiellement rongeurs) à la suite d’une exposition prolongée et répétée.  Portent particulièrement sur les rongeurs  Administration orale  Deux sexes , 20 par groupe Au moins trois niveaux de dose + groupe témoin Fréquence d’exposition quotidienne, Durée d’exposition : au moins 12 mois • Ces études permettent de : - Identifier de la toxicité chronique d’une substance ; les organes cibles ; - Identifier un niveau de (DSENO) ; -Caractériser la relation dose-effet ; -Prévoir les effets de toxicité chronique aux niveaux représentatifs de l’exposition humaine ; -Obtenir des données permettant de vérifier les hypothèses concernant le mode d’action La substance d’essai est administrée oralement par dose graduée à plusieurs groupes de mâles et de femelles Génération parentale P G1 G2 G3 T D1 D2 D3 Reprotoxicité sur une génération Reprotoxicité sur deux génération • uploads/Sante/ tests-in-vivo-et-in-vitro.pdf