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Principes des techniques de biologie moléculaire 2e édition revue et augmentée

Principes des techniques de biologie moléculaire 2e édition revue et augmentée © INRA, Paris, 2003 ISBN : 2-7380-1067-9 ISSN : 1144-7605 Le code de la propriété intellectuelle du 1e r juillet 1992 interdit la photocopie à usage collectif sans autorisation des ayants droit. Le non respect de cette disposition met en danger l'édition, notamment scientifique. Toute reproduction, partielle ou totale, du présent ouvrage, est interdite sans autorisation de l'éditeur et du Centre français d'exploitation du droit de copie (CFC), 20 rue des Grands Augustins, 75006 Paris. Principes des techniques de biologie moléculaire 2e édition revue et augmentée D . Tagu, C . Moussard, éds INSTITUT NATIONAL D E L A R E C H E R C H E AGRONOMIQUE 147 rue de l'Université - 75338 Paris cedex 07 MIEUX COMPRENDRE Ouvrages parus dans la même collection : Eléments de génétique quantitative 2e édition revue et augmentée L. O L L I V I E R 2002,184 p. Génie générique Une histoire, un défi E. H E B E R L E - B O R S trad. M.L. SPIRE, R. J U D O R 2001,304 p. L'eau dans l'espace rural Vie et milieux aquatiques A. N E V E U , C. RIOU, R. B O N H O M M E , P . C H A S S I N , F. P A P Y (éd.) 2001,300 p. Principes de virologie végétale Génome, pouvoir pathogène, écologie des virus S. ASTIER, J. A L B O U Y , Y . M A U R Y , H. L E C O Q 2001,488 p. Le grain de blé Composition et utilisation P. F E I L L E T 2000,310 p. Biology of lactation J . M A R T I N E T , L.-M. H O U D E B I N E , H.H. H E A D 1999,686 p. Sol : interface fragile Pierre S T E N G E L et Sandrine G E L I N 1998,222 p. Les marqueurs moléculaires en génétique et biotechnologies végétales Dominique D E V I E N N E 1998,200 p. Assimilation de l'azote chez les plantes Aspects physiologique, biochimique et moléculaire Jean-François M O R O T - G A U D R Y (éd.) 1997,422 p. L'eau dans l'espace rural Production végétale et qualité de l'eau C. Riou, R. B O N H O M M E , P . C H A S S I N , A. N E V E U , F. P A P Y (éd.) 1997,414 p. La pomme de terre P . R O U S S E L L E , Y . R O B E R T et J.C. C R O S N I E R (éd.) 1996,640 p. Vie microbienne du sol et production végétale Pierre D A V E T 1996,380 p. Nutrition des ruminants domestiques R. J A R R I G E , Y . R U C K E B U S H , C. D E M A R Q U I L L Y , M.-H. F A R C E et M. JouRNET(éd.) 1995,921p. Amélioration des espèces végétales cultivées Objectifs et critères de sélection André G A L L A I S et Hubert B A N N E R O T 1992,768 p. La régression non linéaire : méthodes et applications en biologie Sylvie H U E T , Emmanuel J O L I V E T et Antoine M E S S É A N 1992,250 p. L'épidémiologie en pathologie végétale : mycoses aériennes Frantz R A P I L L Y 1991,318 p. Les oligo-éléments en agriculture et en élevage Yves Coïc et Marcel C O P P E N E T 1989,114 p. Cette seconde édition est une version revue et augmentée de la précédente. Nous tenons à remercier les rédacteurs de ces fiches qui ont su donner de leur temps pour mettre à jour cet ouvrage. SOMMAIRE Définitions 1. Structure et expression d'un gène eucaryote codant un ARNm et une protéine 6 2. Paramètres de description d'un génome 8 3. Séquençage de génomes entiers 12 Vecteurs et clonage 4. Enzymes de restriction 14 5. Ëlectrophorèse des acides nucléiques 16 6. Description d'un plasmide et d'un phagemide 18 7. Description d'un bactériophage et d'un cosmide 20 8. Description d'un YAC et autres grands vecteurs 22 9. Clonage moléculaire 24 10. Transformation génétique des bactéries et des levures 27 Marquage d'acides nucléiques et hybridations 11. Marquage de F ADN 29 12. Hybridation moléculaire 32 13. Hybridation in situ des ARNm 36 Banques d'ADN et criblage 14. Construction d'une banque d'ADN génomique 38 15. Construction d'une banque d'ADNc 40 16. Criblage d'une banque 42 17. Criblage différentiel : banques d'ADNc soustraites, AFLP-ADNc 46 18. Criblage différentiel par DD RT-PCR : tri d'ARNm 50 (differential display RT-PCR) 19. Criblage différentiel par SSH : hybridation soustractive et suppressive 54 {suppression substractive hybridization) 20. Criblage différentiel par RDA : analyse par différence de représentation 58 (representational différence analysis) 21. EST : étiquettes de gènes exprimés (expressed séquence tags) 62 22. Réseaux d'ADN: puces à ADN, filtres d'ADNc 65 Caractérisatîon d'un gène 23. Séquençage d'ADN 76 24. PCR (polymerase chain réaction) 80 25. RACE : amplification rapide d'extrémités d'ADNc 82 (rapid amplification ofcDNAs ends) 26. Marche génomique par PCR 86 27. RT-PCR: PCR sur ARNm (reverse transcriptase PCR) 88 28. Transcription in vitro 90 29. Détermination du site d'initiation de la transcription 92 30. Analyse fonctionnelle de promoteurs 94 31. Gel-retard 96 32. Empreinte à la DNase I (footprinting) 98 Transformations génétiques d'eucaryotes 33. Transformation génétique des végétaux par Agrobacterium tumefaciens 100 34. Transfert direct de gènes dans des protoplastes végétaux 105 35. Transfert direct de gènes par biolistique 106 36. Transformation génétique de cellules animales 107 37. Le clonage des animaux 110 38. Expression transitoire 114 Analyse de ia fonction d'un gène 39. Protéines recombinantes 116 40. Les baculovirus d'insectes, vecteurs d'expression de gènes étrangers 120 41. Système du double hybride 124 42. Mutagenèse dirigée 128 43. Complémentation de mutation chez la Levure 132 44. Inactivation de gènes (knock-ouf) 134 45. Etiquetage moléculaire 136 46. RNAi : inactivation de gènes par interférence d'ARN (RNA interférence) 140 4 Polymorphisme d'un génome 47. Marqueurs génétiques moléculaires 143 48. Cartes génétique et physique 148 49. PFGE : électrophorèse en champs puisés (puise field electrophoresis) 152 50. RFLP : polymorphisme de longueur des fragments de restriction 154 (restriction fragment length polymorphism) 51. RAPD : polymorphisme d'ADN par amplification aléatoire 156 (random amplified polymorphic DNA) 52. AFLP : polymorphisme de longueur de fragments amplifiés 158 (amplified fragment length polymorphism) 53. Les rétromarqueurs 160 54. SSCP : polymorphisme de conformation de l'ADN monocaténaire 164 (single strand conformation polymorphism) 55. DGGE : électrophorèse de l'ADN en gradient de gel dénaturant 166 (denaturing gel gradient electrophoresis) 56. SNP : polymorphisme d'un seul nucléotide 168 (single nucléotide polymorphism) 57. SSR : microsatellites, répétitions de séquences simples 170 (simple séquence repeats) Liste des rédacteurs 175 FICHE 1 STRUCTURE ET EXPRESSION D'UN GÈNE EUCARYOTE CODANT U N ARNm ET UNE PROTÉINE Un gène eucaryote à ARNm comporte une séquence codante bordée de séquences de régulation. Ces dernières servent de signaux de début ou de fin de transcription du gène par l'ARN polymérase II. Certaines de ces séquences (p. ex. la TATA box du promoteur) sont reconnues par des protéines appelées "facteurs de transcription généraux" car elles assistent cette enzyme dans les étapes d'initiation et d'élongation de la transcription. D'autres séquences d'ADN 1 sont reconnues par des "facteurs de transcription spéci- fiques" qui modulent l'expression des gènes dans l'espace (selon le type de cellule), dans le temps (au cours du développement) et/ou sous l'effet de stress. L'agencement de ces protéi- nes sur l'ADN déclenchera ou inhibera la transcription du gène. La séquence codante est constituée d'exons et d'introns. Ces deux types de séquences sont transcrites (transcrit primaire), mais les introns sont éliminés lors de l'épissage. L'ARN est d'abord modifié en 5'-P (addition d'une coiffe) et en 3'-OH (addition de nucléotides à adéni- ne), puis épissé (élimination des introns) avant d'être transporté dans le cytoplasme. Là, les ribosomes se fixent sur l'ARNm (ARN messager) et, par l'intermédiaire des ARNt (ARN de transfert), l'ARNm est traduit en le polypeptide correspondant. 1 . Elles peuvent se trouver en aval et/ou en amont de la séquence codante. DENIS T A G U FICHE 2 PARAMÈTRES DE DESCRIPTION D'UN GÉNOME Paramètres 1 c Quantité d'ADN par noyau 2C : de l'ordre du picogramme (1 pg = 10~1 2 g). e Longueur totale de l'ADN : exprimée en paire de bases (pb), en kilopb (kpb), en mégabases (1 Mb = 10 6 pb). . Pourcentage en G + C : pourcentage de bases cytosine et guanine dans une séquence d'ADN connue. « Diamètre de l'ADN : 20 A. Un morceau d'ADN de 1 A de longueur a une masse de 193/6.10 2 3 g. o 1 paire de bases a une uploads/S4/ techniques-de-biologie-moleculaie 1 .pdf