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AT 12 Biotechnologies Antibiogramme d’un germe responsable d’une infection urin

AT 12 Biotechnologies Antibiogramme d’un germe responsable d’une infection urinaire Yves DABAT Ste-Anne ANGLET Thème : ECBU Semaine 5 Antibiogramme Antibiogramme en milieu solide de Mueller Hinton INTRODUCTION J1 : Antibiogramme LES ANTIBIOTIQUES : Molécule qui détruit ou bloque la croissance des bactéries  Les AB ne guérissent que les infections bactériennes  Ils sont inactifs sur les autres « microbes » (les virus, les parasites, les champignons) Aucun Ab n’est actif sur l’ensemble des bactéries J1 : Antibiogramme LES ANTIBIOTIQUES : VIRUS Ex: v.influenzae (grippe) BACTERIES Ex: E. Coli (infection urinaire) PARASITES Ex: sarcoptes (gale) CHAMPIGNONS Ex: C Albicans (mycose buccale) TT= ANTIBIOTIQUES TT= ANTIVIRAUX (ou symptomatique) TT= ANTIFONGIQUES TT= ANTIPARASITAIRES J1 : Antibiogramme LES ANTIBIOTIQUES : Chez l’homme 2 types de bactéries Commensales Pathogènes Les antibiotiques ne doivent détruire que les bactéries pathogènes ! Antibiogramme Antibiogramme en milieu solide de Mueller Hinton Jour 1 J1 : Orientation MACROSCOPIE On dispose d’une souche pure isolée sur une gélose lactosée au BCP. Lecture du milieu : Observation : Un seul type de colonies. Les colonies sont de type M, translucides. Le milieu a viré du violet au jaune sous les colonies. Les bactéries sont donc lactose+. J1 : Orientation MACROSCOPIE On dispose d’une souche pure isolée sur une gélose lactosée au BCP. Lecture du milieu : Interprétation : Les bactéries ont dégradé le lactose en composés acides. Le pH a diminué. L’indicateur coloré est passé du violet au jaune. J1 : Orientation MACROSCOPIE On dispose d’une souche pure isolée sur une gélose lactosée au BCP. Lecture du milieu : Conclusion : Les bactéries sont non-exigeantes et lactose + Étude microscopique : Gram : BGN polymorphes, 2 à 8 µm de longs pour 1 µm de large, extrémités arrondis. Beaucoup de coccobacilles, coloration bipolaire, en amas irréguliers. État frais : Bacilles mobiles J1 : Orientation Recherche de l’oxydase : Bactéries oxydase moins J1 : Orientation Orientation (caractères de famille) : BGN Non-exigeants Oxydase moins Famille des Enterobacteriaceae J1 : Orientation On peut supputer que la bactérie fait partie du groupe des Coliformes qui contient quatre genres lactoses + : Genres Escherichia, Klebsiella, Citrobacter et Enterobacter. J1 : Antibiogramme Antibiogramme : On ensemence un milieu de Mueller Hinton par la technique de l’écouvillonnage : Matériel Isolement sur milieu non-sélectif 2 tubes de 5 ml EDS 1 pipette Pasteur MacFarland 0,5 1 Mueller Hinton 1 écouvillon stérile 6 disques Ab Abaque Pince métallique J1 : Antibiogramme Milieux en fonction des bactéries Organismes Milieu Enterobactéries Pseudomonasspp. Stenotrophomonas maltophilia Acinetobacterspp. Staphylococcusspp. Enterococcusspp. Gélose de Mueller-Hinton J1 : Antibiogramme Milieux en fonction des bactéries Streptococcus pneumoniae Streptococcus des groupes A, B, C et G Streptocoques du groupe viridans Haemophilusspp. Moraxella catarrhalis Listeria monocytogenes Pasteurella multocida Campylobacter jejunietC.coli Corynebacteriumspp. Gélose de Mueller-Hinton + 5% de sang de cheval défibriné + 20 mg/L β-NAD (MH-F) J1 : Antibiogramme On prépare une dilution au 1/100 en EDS : Dans un tube EDS 5 mL, on prépare une suspension d’opacité Mac Farland 0,5. On dilue cette suspension au 1/100 : 1 goutte dans 5 mL d’EDS. J1 : Antibiogramme On ensemence un milieu de Mueller Hinton par la technique de l’écouvillonnage : On trempe l’écouvillon dans la suspension diluée au 1/100 J1 : Antibiogramme Technique Trois beurrages à 3 fois soixante degrés. On ensemence un milieu de Mueller Hinton par la technique de l’écouvillonnage : J1 : Antibiogramme Technique Trois beurrages à 3 fois soixante degrés. On ensemence un milieu de Mueller Hinton par la technique de l’écouvillonnage : J1 : Antibiogramme Technique Il existe des méthodes automatiques Trois beurrages à 3 fois soixante degrés. On ensemence un milieu de Mueller Hinton par la technique de l’écouvillonnage : J1 : Antibiogramme On dépose ensuite les six antibiotiques fournis grâce à une abaque (boîte posée sur l’abaque) : J1 : Antibiogramme Il existe des distributeurs automatiques qui distribuent 4 ou 6 disques en même temps. J1 : Antibiogramme Aspect de la boîte après dépôt des disques : Voici les disques posés. On incube la boîte 24 heures à 37°C J1 : Antibiogramme Résumé du protocole d’inoculation des boîtes : • Partir de colonies obtenues après une nuit de culture sur des milieux non sélectifs. • Ajuster l’inoculum de façon à obtenir un trouble comparable à celui du tube 0.5 de la gamme de McFarland de préférence à une méthode spectrométrique. Utiliser l’inoculum ainsi préparé dans un délai 15 minutes. • Plonger un écouvillon stérile dans la suspension bactérienne , rejeter l’excès de liquide en tournant sur la paroi interne du tube. • Bien étaler l’inoculum sur la totalité de la surface de la gélose • Après ensemencement des boîtes, déposer les disques dans un délai maximum de 15 minutes et incuber les boîtes dans un délai maximum de 15 minutes. J1 : Antibiogramme LA REGLE DES TROIS FOIS 15 MINUTES : • Utiliser l’inoculum dans les 15 minutes suivant sa préparation sans jamais dépasser 60 minutes. • Appliquer les disques dans les 15 minutes qui suivent l’inoculation des boîtes. • Incuber dans les 15 minutes qui suivent l’application des disques. J1 : Antibiogramme Diffusion des antibiotiques pendant l’incubation : Pendant 24 heures les bactéries se multiplient pour donner des colonies tandis que les antibiotiques migrent lentement dans la gélose. J1 : Antibiogramme Diffusion des antibiotiques pendant l’incubation : Début : Le disque vient d’être posé à la surface de la gélose. Fin : Pendant 24 h, l’antibiotique migre lentement dans la gélose en créant un gradient de concentration. Antibiogramme Antibiogramme en milieu solide de Mueller Hinton Jour 2 J2 : Antibiogramme Lecture des résultats : On mesure la valeur de tous les diamètres d’inhibition en millimètres. Pour chaque antibiotique, on compare le diamètre mesuré aux valeurs des diamètres critiques « d » et « D » qui correspondent aux concentrations critiques en antibiotiques « C » et « c ». J2 : Antibiogramme Lecture des résultats : Aspect de la boîte après 24 h d’incubation à 37°C. J2 : Antibiogramme Lecture des résultats : Diamètre d’inhibition = 28 mm On mesure le diamètre d’inhibition avec une règle J2 : Antibiogramme Lecture des résultats : Aux regards des concentrations et des diamètres critiques sont considérées comme : • Sensibles(S), les souches pour lesquelles la CMI de l'antibiotique testé est inférieure ou égale à la concentration critique basse (c), ce qui équivaut à un diamètre supérieur ou égal au diamètre critique D; • Résistantes (R), les souches vis-à-vis desquelles la CMI de l'antibiotique testé est supérieure à la concentration critique haute C, correspondant à un diamètre inférieur au diamètre critique d; • De sensibilité intermédiaire (I), les souches vis-à-vis desquelles la CMI de l'antibiotique testé et du diamètre correspondant sont compris entre les deux concentrations critiques et les deux diamètres critiques. J2 : Antibiogramme Lecture des résultats : J2 : Antibiogramme Lecture des résultats : J2 : Antibiogramme Lecture des résultats : Germe résistant J2 : Antibiogramme Lecture des résultats : Germe intermédiaire J2 : Antibiogramme Lecture des résultats : Germe sensible J2 : Antibiogramme Lecture des résultats : Exemple de lecture d’une zone d’inhibition pour GM Le diamètre d’inhibition est supérieur à D ; Le germe est donc sensible à cet antibiotique. La CMI est donc inférieure à la CCI (c) ; J2 : Antibiogramme Lecture des résultats : Trois catégories cliniques ont été retenues pour l'interprétation des tests de sensibilité in vitro : Sensible (S), Résistant (R) et Intermédiaire (I). • Les souches catégorisées S sont celles pour lesquelles la probabilité de succès thérapeutique est forte dans le cas d’un traitement par voie systémique avec la posologie recommandée dans le résumé des caractéristiques du produit (RCP). • Les souches catégorisées R sont celles pour lesquelles il existe une forte probabilité d'échec thérapeutique quels que soient le type de traitement et la dose d'antibiotique utilisée. • Les souches catégorisées I sont celles pour lesquelles le succès thérapeutique est imprévisible. Ces souches forment un ensemble hétérogène pour lequel les résultats obtenus in vitro ne sont pas prédictifs d'un succès thérapeutique J2 : Antibiogramme Interprétation des résultats : Nom Ab Sigle Ab Diamètre zone inhibition (mm) CMI ? À comparer avec c et C Conclusion : R = résistant I = intermédiaire S = sensible Tétracycline TE Ampicilline AM Gentamycine GM Néomycine N Kanamycine K Pénicilline P 19 5 25 25 23 19 S R S S S R J2 : Antibiogramme Interprétation des résultats : Une thérapie est inenvisageable pour les quatre antibiotiques : Tétracycline, Kanamycine, Néomycine et Gentamycine. Une thérapie est impossible avec les deux antibiotiques : Pénicilline et ampicilline. Conclusion L’antibiotique le plus approprié semble être la gentamycine car c’est lui qui présente le plus grand diamètre d’inhibition sur milieu MH. Conclusion à la semaine 5 CONCLUSION CONCLUSION Toutes ces techniques permettent de conclure sur la résistance ou la sensibilité de la souche d’E. coli à divers antibiotiques. Elles permettent aussi de dire si un antibiotique est utilisable ou non pour une thérapie. CMI et Antibiogramme Semaine 5 : Antibiotiques FIN Yves DABAT Ste-Anne ANGLET uploads/Finance/ at12-antibiogramme-milieu-solide-2018.pdf