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1 TECHNIQUES EN MICROSCOPIE M1 PHOTONIQUE 2020-2021 2 TECHNIQUES EN MICROSCOPIE

1 TECHNIQUES EN MICROSCOPIE M1 PHOTONIQUE 2020-2021 2 TECHNIQUES EN MICROSCOPIE M1 PHOTONIQUE 2020-2021 Table des matières INTRODUCTION GÉNÉRALE ........................................................................................................... 7 HISTORIQUE ....................................................................................................................................... 8 CONDITIONS GENERALES D’OBSERVATION EN MICROSCOPIE ......................................... 12 CHAPITRE I : LA MICROSCOPIE OPTIQUE ................................................................................ 13 INTRODUCTION ............................................................................................................................... 13 I. CONSTITUTION DU MICROSCOPE OPTIQUE ......................................................................... 14 I.1. LE MIROIR ................................................................................................................................ 15 I.2. LA SOURCE DE LUMIÈRE ..................................................................................................... 15 I.3. LE DIAPHRAGME ................................................................................................................... 15 I.4. LE PORTE-ÉCHANTILLON .................................................................................................... 16 I.5. L’OBJECTIF .............................................................................................................................. 16 I.6 L’OCULAIRE .............................................................................................................................. 17 II. PRINCIPE DE FONCTIONNEMENT .......................................................................................... 17 III. CARACTÉRISATION DU MICROSCOPE OPTIQUE .............................................................. 18 III.1 LE GROSSISSEMENT ............................................................................................................. 18 III.2. LE POUVOIR DE RÉSOLUTION .......................................................................................... 19 III.4. MODES D’ILLUMINATION DE L'ÉCHANTILLON ............................................................ 20 3 TECHNIQUES EN MICROSCOPIE M1 PHOTONIQUE 2020-2021 III.4.1. ECLAIRAGE CRITIQUE : .................................................................................................... 21 III.4.2. ECLAIRAGE DE KÖHLER : ................................................................................................. 21 IV. LES DIFFÉRENTS TYPES DE MICROSCOPIE OPTIQUE ET LEURS APPLICATIONS .... 21 IV.1. LA MICROSCOPIE EN CONTRASTE DE PHASE ................................................................ 21 IV.2. LA MICROSCOPIE DE FLUORESCENCE [4] ....................................................................... 23 IV.2.1. NOTION DE FLUORESCENCE : .......................................................................................... 23 IV.2.2. PRINCIPE OPTIQUE DU MICROSCOPE ............................................................................ 24 IV.2.3. SOURCES DE LUMIÈRE : .................................................................................................... 25 IV.2.4. FILTRES ................................................................................................................................. 27 IV.2.5. EXEMPLES D’APPLICATIONS DE LA MICROSCOPIE EN FLUORESCENCE ............ 28 IV.2.6. LIMITES DE LA MICROSCOPIE EN FLUORESCENCE .................................................. 29 IV.3. LA MICROSCOPIE CONFOCALE [4] ................................................................................... 29 IV.3.1. PRÉSENTATION .................................................................................................................... 29 IV.3 .2. NÉCESSITÉ DE LA MICROSCOPIE CONFOCALE ......................................................... 31 IV.3. 3. FONCTIONNEMENT DU MICROSCOPE CONFOCAL, INVENTÉ PAR MARVIN MINSKY ET BREVETÉ EN 1957 ...................................................................................................... 31 IV.4. LA MICROSCOPIE À FOND CLAIR ET NOIR ..................................................................... 35 IV.4.1. LA MICROSCOPIE OPTIQUE À FOND NOIR ................................................................... 35 IV.4.1.1 PRINCIPE .............................................................................................................................. 36 4 TECHNIQUES EN MICROSCOPIE M1 PHOTONIQUE 2020-2021 IV.4.1.2. APPLICATION .................................................................................................................... 36 IV.4.2. LA MICROSCOPIE OPTIQUE À FOND CLAIR ................................................................. 37 V. LIMITES DE LA MICROSCOPIE OPTIQUE ............................................................................. 37 CHAPITRE II : LA MICROSCOPIE ELECTRONIQUE ................................................................. 38 INTRODUCTION ............................................................................................................................... 38 I. PRINCIPES DE BASE ..................................................................................................................... 39 II. LA MICROSCOPIE ÉLECTRONIQUE À BALAYAGE (MEB) ................................................. 41 II.1 DESCRIPTION ............................................................................................................................. 42 II.2 PRINCIPES DE FONCTIONNEMENT ...................................................................................... 42 II.2.1. INTERACTION ENTRES ÉLECTRONS ............................................................................... 43 II.2.2. ELECTRONS SECONDAIRES ............................................................................................... 43 II.2.3. ELECTRONS RÉTRODIFFUSÉS ........................................................................................... 45 II.2.4. ELECTRONS AUGER ............................................................................................................. 46 II.2.5. LES RAYONS X ....................................................................................................................... 47 II.3. APPLICATION DE LA MICROSCOPIE ÉLECTRONIQUE À BALAYAGE ...................... 47 III. LA MICROSCOPIE ÉLECTRONIQUE EN TRANSMISSION (TEM) ..................................... 47 III.1 DESCRIPTION ........................................................................................................................... 47 III.2. PRINCIPES DE FONCTIONNEMENT .................................................................................... 48 III.2.1. INTERACTION AVEC LA MATIÈRE ................................................................................. 50 5 TECHNIQUES EN MICROSCOPIE M1 PHOTONIQUE 2020-2021 III.2.2. LENTILLES MAGNÉTIQUES : ............................................................................................ 51 III.3. APPLICATIONS ........................................................................................................................ 51 CHAPITRE III :LA MICROSCOPIE A CHAMP PROCHE ............................................................ 52 INTRODUCTION ............................................................................................................................... 52 I. LA MICROSCOPIE A EFFET TUNNEL (STM) ........................................................................... 53 I.1. PRINCIPES DE FONCTIONNENT ........................................................................................... 53 I.1.1. L’EFFET TUNNEL .................................................................................................................... 53 I.1.2. PRINCIPE .................................................................................................................................. 54 I.2 APPLICATION ............................................................................................................................ 56 I.3. LIMITE D’UTILISATION ......................................................................................................... 56 II. MICROSCOPIE A FORCE ATOMIQUE (AFM) ......................................................................... 57 II.1. GÉNÉRALITÉ ............................................................................................................................. 57 II.2. PRINCIPE GÉNÉRAL .............................................................................................................. 58 II.2.1. PRINCIPE DE BASE ................................................................................................................. 58 II.2.2. APPAREILLAGE .................................................................................................................. 59 II.3. L’AFM EN FONCTIONNEMENT .......................................................................................... 62 II.3.1. LA MESURE DE LA DÉVIATION..................................................................................................................62 II.3.2. RÉTROACTION.....................................................................................................................................63 II.3.3. LES DIFFÉRENTS MODES DE FONCTIONNEMENT..............................................................................................63 II.3. APPLICATION DE L’AFM ........................................................................................................ 65 6 TECHNIQUES EN MICROSCOPIE M1 PHOTONIQUE 2020-2021 CHAPITRE IV : MICROSCOPIE ACOUSTIQUE ........................................................................... 70 I. GÉNÉRALITÉS SUR LA MICROSCOPIE ACOUSTIQUE ........................................................ 70 III. MICROSCOPE ACOUSTIQUE : PRINCIPE DE FONCTIONNEMENT ................................. 72 II.1. CARACTÉRISTIQUES D’UNE ONDE ULTRASONORE ....................................................... 72 II.2. PRINCIPE DE FONCTIONNEMENT DU MICROSCOPE ACOUSTIQUE ........................... 73 II.2.1. TRANSDUCTEUR ACOUSTIQUE ......................................................................................... 75 II.2.2. LIGNE À RETARD .................................................................................................................. 75 II.2.3. LENTILLE ACOUSTIQUE ..................................................................................................... 75 II.2.4. LE LIQUIDE DE COUPLAGE ................................................................................................ 76 II.2.5. RÉSOLUTION .......................................................................................................................... 76 III. APPLACATION ............................................................................................................................ 77 CONCLUSION GENERALE .............................................................................................................. 78 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUE .............................................................................................. 79 7 TECHNIQUES EN MICROSCOPIE M1 PHOTONIQUE 2020-2021 Introduction générale La microscopie est un ensemble de techniques permettant d'obtenir une image des structures à l’échelle microscopique. Le principe est dans tous les cas le même : une onde est envoyée sur la préparation ou émise par la préparation. Cette onde est captée par un objectif qui la concentre et passe par un oculaire qui crée une image observable. Cette image est soit observée à l’œil nu, soit photographiée, soit enregistrée par caméra CCD et stocké sur ordinateur pour retraitement. L'image obtenue est beaucoup plus qu'un instantané de la préparation. Les techniques de révélation permettent aujourd'hui d'identifier de façon précise toutes sortes de molécules et les photographies (sur pellicules ou numériques) peuvent être analysées pour des études quantitatives (taille, nombre et emplacement des éléments observés). Il n'y a pas une technique microscopie mais plusieurs dizaines aboutissant à des résultats différents. Il n'y a aucune comparaison entre les images plates et peu contrastées d'un microscope en contraste de phase, celles très fines d'un microscope électronique ou les reconstitutions multichromes en 3D d'un microscope confocal., toutefois seule la première technique permet de travailler sur des tissus vivants. Aujourd'hui la microscopie est divisée en trois grands groupes, différents par la nature de la particule élémentaire impliquée [1] : • le microscope optique, aussi appelé photonique, parce qu'il utilise des photons, • le microscope électronique qui utilise des électrons pour étudier l'objet, • le microscope à champ proche qui utilise la force atomique et l’effet tunnel. 8 TECHNIQUES EN MICROSCOPIE M1 PHOTONIQUE 2020-2021 Historique L'invention du microscope n'a pas été suffisamment documentée en son temps pour permettre une conclusion définitive concernant son auteur et sa date, mais la première illustration d'un microscope reconnaissable date de 1625 (Fig.4). Au 17ème siècle, les microscopes "composés", consistant en une combinaison de lentilles en deux groupes : objectif (près de l'objet) et oculaire (à travers quoi vous regardez) étaient utilisés par de nombreux observateurs mais la qualité de l'image était pauvre .. Il y avait une alternative : le microscope "simplex", consistant en une seule lentille, comme les loupes qui sont toujours utilisées mais avec une puissance beaucoup plus grande. C'était le type d'instrument utilisé par Antonie van Leeuwenhoek aux alentours de 1700. Avec un même grossissement, ce type de microscope donnait une bien meilleure image que le microscope composé. La Fig.5 montre la qualité de l'image obtenue avec un microscope "simplex" (ou une loupe très puissante) fait par l'auteur de l'article original. Le désavantage de ce type de microscope est qu'il est pratiquement impossible de travailler avec : proche des instruments de van Leeuwenhoek, le magnifique instrument de van Musschenbroek (Fig.6) est tenu à la main, touche pratiquement l'œil de l'utilisateur et ce dernier doit essayer de voir à travers une très petite lentille (env. 2 mm de diamètre). C'est la principale raison pour laquelle l'étonnante variété des découvertes de van Leeuwenhoek - des stries du muscle aux bactéries, décrites dans plus de 560 lettres à la Société Royale de Grande-Bretagne - ne déboucha pas dans une introduction à large échelle du microscope "simplex" pour la recherche [2] 9 TECHNIQUES EN MICROSCOPIE M1 PHOTONIQUE 2020-2021 ht tp://www.labomediqual.ch/microscope/img/Fig05.jpg (consultée le 03/06/2021) http://www.labomediqual.ch/microscope/img/Fig06.jpg (Un microscope à une seule lentille est traditionnellement appelé microscope "simple". L'auteur a intentionnellement changé cette appellation en microscope "simplex" pour éviter une confusion avec les types les plus simples de microscopes modernes, comme par exemple un microscope d'étudiant) Les défauts de qualité de l'image - spécialement la perte des fins détails due à la présence de franges colorés - sont aussi connue du télescope. A la fin du 18ème siècle, on a découvert qu'un objectif de télescope consistant en une combinaison de lentilles faites de différentes sortes de verre pouvait réduire fortement les franges colorées, conduisant ainsi à une révolution de l'optique. De telles lentilles sont appelées "achromatiques", c'est à dire sans couleur. Au début du 19ème siècle, ce principe a également été appliqué aux lentilles des objectifs des microscopes composés. Ensemble les études empiriques et théoriques de chercheurs comme Lister en Angleterre et Amici en Italie ont conduit à une amélioration continue. D'environ 1850 à 1870, les fabricants d'instrument anglais comme Power & Lealand, Ross et Beck dominent le marché. Ces microscopes victoriens (Fig.7) avec une longueur de tube de 10 pouces sont vraiment des exemples monumentaux des fabricants de l'époque. Les diatomistes voulant résoudre les plus fins détails créèrent une forte demande pour l'amélioration de l'optique et formèrent donc un important marché [2] 10 TECHNIQUES EN MICROSCOPIE M1 PHOTONIQUE 2020-2021 http://www.labomediqual.ch/microscope/img/Fig07.jpg http://www.labomediqual.ch/microscope/img/Fig08.jpg (consultée le 03/06/2021) Sur le continent européen, un modèle plus petit et plus simple (longueur du tube d'environ 160 mm, Fig.8) est devenu le standard et dès 1870, les performances optiques des lentilles produites par les opticiens européens tels que Hartnack ont rattrapé les anglais. Le fabricant allemand Carl Zeiss s'est ensuite allié avec un physicien, Ernst Abbe, qui a été le premier à créer une théorie de la formation des images complète pour le microscope. Combinant les travaux précédents avec ses propres études, Abbe a développé un traitement mathématique rigoureux de conception des lentilles. De concert avec le développement de nouveaux types de verre, cela a augmenté le pouvoir de résolution du microscope aux limites de ce qui est physiquement possible. Les travaux d'Abbe étaient du domaine public comme nous le dirions aujourd'hui, si bien que tous les concepteurs ont pu utiliser ses données pour perfectionner leurs propres produits. Depuis environ uploads/Finance/ redact-microscopie.pdf