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HAL Id: tel-01149642 https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-01149642 Submitted on 7 May 2015 HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers. L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d’enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés. Clonage et caractérisation de deux gènes codant des enzymes lipolytiques de la microalgue Isochrysis galbana Vincent Kerviel To cite this version: Vincent Kerviel. Clonage et caractérisation de deux gènes codant des enzymes lipolytiques de la microalgue Isochrysis galbana. Sciences agricoles. Université du Maine, 2014. Français. NNT : 2014LEMA1017. tel-01149642 i Vincent KERVIEL Mémoire présenté en vue de l’obtention du grade de Docteur de l’Université du Maine sous le label de l’Université Nantes Angers Le Mans Ecole doctorale : V.E.N.A.M. Discipline : Sciences du Vivant Spécialité : Biologie des Organismes Unité de recherche : EA 2160 Mer Molécules Santé (MMS) Présentée et soutenue publiquement le 23/09/2014 Thèse N° : JURY Rapporteurs : Dr. David COBESSI, Chargé de Recherche HDR-CNRS, IBS-Grenoble Dr. Frédéric DOMERGUE, Chargé de Recherche HDR-CNRS, Université de Bordeaux Examinateurs : Pr. Benoît SCHOEFS, Professeur des Universités, Université du Maine-Le Mans Pr. Elisabeth PETIT-TEIXEIRA, Professeur des Universités, Université d’Evry-Val d’Essonne Directeur de Thèse : Pr. Françoise ERGAN, Professeur des Universités, Université du Maine-Laval Co-encadrant de Thèse : Dr. Céline LOISEAU, Maître de Conférences, Université du Maine-Laval Membre invité : Dr. Jean-Luc JUNG, Maître de Conférences, Université de Bretagne Occidentale-Brest Membre invité et co-encadrant de la thèse : Dr. Laurent POISSON, Maître de Conférences, Université du Maine-Laval Clonage et caractérisation de deux gènes codant des enzymes lipolytiques de la microalgue Isochrysis galbana ii iii REMERCIEMENTS Les travaux présentés dans ce mémoire ont été réalisés au sein du laboratoire Mer, Molécules, Santé (MMS), dans sa composante basée à Laval en Mayenne dans l’équipe ChimiMar de l’axe 3 «CHIM » de MMS. L’équipe prend place au sein du Département de Génie Biologique de l’IUT de Laval. Je remercie les Collectivités locales Mayennaises pour avoir financé ces travaux de Recherche. Je remercie Monsieur David Cobessi, Chargé de Recherche HDR au CNRS et Monsieur Frédéric Domergue, Chargé de Recherche HDR au CNRS, qui m’ont fait l’honneur d’accepter de juger ce travail et d’en être rapporteurs. Je remercie Madame Elisabeth Petit-Teixeira, Professeur à l’Université d’Evry-Val d’Essone et Monsieur Benoît Schoefs, Professeur à l’Université du Maine pour avoir accepté de participer à ce jury de thèse. Je remercie Françoise Ergan, Professeur de l’Université du Maine, pour m’avoir accueilli dans son laboratoire de recherche et pour le soutien qu’elle m’a apporté tout au long de ce projet. J’exprime toute ma reconnaissance envers Céline Loiseau et Laurent Poisson, Maitres de Conférences à l’Université du Maine, pour avoir co-encadré ce travail. Céline, merci d’avoir su être là pour tous les moments de cette thèse, les bons, les mauvais et les excellents moments et particulièrement pour le temps consacré à la correction de ce manuscrit. Je remercie chaleureusement Josiane Hérault, pour avoir toujours su me donner des raisons d’avancer, de croire et de persister dans ce projet. Des premières difficultés jusqu’ici, tu auras toujours été là pour avoir ce regard si précieux sur mon travail, merci. Je remercie Gaëlle Pencreac’h, pour avoir su être à l’écoute, pour les nombreuses discussions sur la pédagogie de l’enseignement, sur la recherche dans son ensemble et l’aboutissement de ce projet en particulier. Je remercie l’ensemble des enseignants-chercheurs du laboratoire MMS de Laval, pour leur gentillesse et leurs précieux conseils. Je tiens à remercier également l’ensemble des enseignants du Département Génie Biologique et particulièrement Françoise Lourdais et Gilles Braud pour m’avoir permis d’apprécier le travail pédagogique et d’orientation à réaliser auprès des étudiants. J’attendais tellement de transmettre des connaissances, vous avez su me guider et rendu cette expérience… géniale. iv Je remercie enfin le service technique du Département. Isabelle Martin, Frédérique Guéno et Rose-Marie LeRoux qui animent et gèrent l’ensemble des matériels et commandes, avec vous rien n’est impossible. Je remercie toutes les personnes avec qui j’ai pu partager tout au long de ces quatre années au sein de l’IUT de Laval et du PRES des Pays de la Loire, les pauses café, les repas, l’organisation de congrès, ce sont des moments privilégiés. Je pense très fort à Catherine, Muriel, François, Marie-Claude pour l’esprit de famille qu’ils m’ont témoigné durant ces 4 ans. Merci à tous mes amis, thésards, sportifs, docteurs, alsaciens, mayennais, chinois, marocains, post-docs, DR, CR1, CR2, vous êtes loin, je ne vous oublie pas, la vie universitaire ou associative nous a permis de nous connaitre, vous êtes ma seconde famille. Merci à Gaël, Nath’, Céline, Aude et Guillaume pour votre soutien, merci à Anaïs & Co pour le soutien durant ma rédaction. Merci Jo, Nadège pour votre patience. Merci à Franck, merci à Gisèle et un merci tout particulier à Sophie qui m’a soutenu et a permis que tout cela se réalise. A ma famille, A mon Grand Père, là où tu es j’espère que tu es fier de moi. v Laboratoire Mer, Molécules, Santé EA 2160 Equipe ChimiMar – Laval IUT de Laval – 52 rue des Docteurs Calmette et Guérin 53020 Laval Cedex vi vii RESUME/ABSTRACT Résumé Les enzymes lipolytiques sont des ester hydrolases impliquées dans le métabolisme lipidique. Leurs caractéristiques se sont révélées être des atouts dans de nombreuses applications industrielles. Chez les microalgues, l’isolement et la caractérisation de ces enzymes d’un point de vue structural et fonctionnel restent des domaines de recherche peu explorés à ce jour. Certaines espèces bénéficient pourtant de contenus en lipides intéressants, source de matière première pour les industries de l’agroalimentaire ou de l’énergie. Par exemple, l’acide docosahexaénoique (DHA), un acide gras polyinsaturé de la série des omégas 3, est reconnu pour ses propriétés en santé humaine. Parmi de nombreuses espèces, Isochrysis galbana, une microalgue unicellulaire appartenant à la classe des Prymnesiophycées est considérée comme une source possible de DHA. La présence d’acides gras libres a été montrée par l’analyse des lipides, suggérant la présence d’enzymes lipolytiques potentiellement intéressantes pour leur sélectivité et leur spécificité de substrat. L’analyse d’une banque de marqueurs de séquences exprimées a permis l’identification de séquences susceptibles de coder des enzymes lipolytiques. Les ARN messagers ont été extraits et les ADN complémentaires ont été clonés. Ce travail de thèse présente l’analyse et le clonage de deux gènes codant une ester hydrolase putative et une thioestérase putative, issues de la microalgue Isochrysis galbana. Les deux séquences codent des protéines de poids moléculaires de 35,41 kDa et de 42,31 kDa. Elles montrent 30 à 40 % d’identité et de similarité avec des hydrolases α/β notamment des carboxylestérases de différents organismes. Les séquences protéiques ont permis l’identification du pentapeptide consensus Gly-X-Ser-X-Gly caractéristique des enzymes lipolytiques et les acides aminés Ser/Asp/His de la triade catalytique. Les deux séquences codantes ont été clonées et exprimées dans la levure Saccharomyces cerevisiae et la bactérie Escherichia coli. Le clonage dans E. coli a permis d’identifier à la taille attendue une protéine par Western blot. En présence de cette protéine, la composition en acides gras des lipides de la bactérie a été modifiée. L’analyse CPG a notamment montré une augmentation des proportions en acides gras C16 :1 et C18 :1 par rapport au témoin. Ce résultat permet de caractériser l’activité thioestérase pour IgTeCe. Mots clés : Ester hydrolase, Isochrysis galbana, Expression de protéines, Acides gras. Abstract Lipolytic enzymes present in all known species play a key role in lipid metabolism and are involved in several industrial processes. They catalyse lipid hydrolysis and synthesis. Actually and particularly in microalgae, isolation and characterization of this type of enzyme remains an unexplored research area. The potential of the lipidic content of microalgae in food industry or energy field requires specific lipolytic enzymes. Docosahexaenoic acid (DHA), an ω3 poly insaturated fatty acid (ω3 PUFA) is well known for its beneficial effects on human health. Among many species, Isochrysis galbana, a unicellular marine microalga belonging to the Prymnesiophyceae class, is considered as a potential alternative source of DHA. Lipid analysis of I. galbana shows free fatty acids and suggests the presence of lipolytic enzymes with potential interesting selectivities and substrate specificities. Analysis of incomplete expressed sequence tag (EST) listed in the EST bank of Isochrysis galbana, identified incomplete genes that encode lipolytic enzymes. Messenger RNAs were extracted, characterized and cloned. This work describes the analysis and cloning of two genes encoding a putative ester hydrolase and a putative thioesterase in marine microalgae Isochrysis galbana. Sequences encode two proteins with predicted molecular weights of approximately 35,41 kDa and 42,31 kDa. Slight similarity and identity (from 30 to 40 %) were observed between the gene sequence and various α/β fold hydrolase found in diverse phyla (including carboxylesterase). Sequences also included the consensus Gly-X-Ser-X-Gly and the catalytic triad Ser/Asp/His. To characterize the predicted enzymatic functions, an experimental procedure uploads/Geographie/ 2014lema1017.pdf