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République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de l’enseignement Sup

République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de l’enseignement Supérieur et de la recherche scientifique Université Mouloud Mammeri de Tizi-Ouzou Faculté des Sciences biologiques et des Sciences Agronomiques Département de Biochimie-Microbiologie Mémoire de fin d’études En vue de l’obtention du diplôme de MASTER en biologie Option : Biochimie appliquée Thème : Réalisé par Melle : MALKI NASSIMA Melle : BENYACOUB HAYET Devant le jury : Président : Mr Ouelhadj A. Promoteur : Mr Amrouche T. Examinateur 1 : Mme Abdoune-Ouali Examinateur2 : Mr Ferdji A. Etude de l’effet combiné de l’acide lactique et du chitosane sur la croissance de quelques bactéries et mycètes pathogènes Promotion 2014 /2015 Remerciements Avant tout, nous tenons à remercier notre bon Dieu « Tous puissant » de nous avoir accordé la force, le courage et la patience afin de réaliser ce modeste travail. Au terme de ce travail, nous voulons d’abord adresser à notre promoteur Dr AMROUCHE Tahar à qui on adresse nos sincères remerciements pour avoir dirigé ce mémoire et mis à notre disposition les moyens nécessaires pour le réaliser. Nos remerciements s’adressent aussi à Dr KADDOUCHE Slimane qui nous a bien accueillis dans son laboratoire chimie de l’université Mouloud Mammeri Tizi-Ouzou, et nous aidé à obtenir le chitosane. Que toutes les personnes ayant contribué de près ou de loin à la réalisation de ce modeste travail soient vivement remerciées. On tient à remercier aussi Mr KADDOUCHE Slimane qui nous a aidés à suivre notre partie de stage pratique au niveau du laboratoire chimie de l’université Mouloud Mammeri Tizi-Ouzou Je dédie ce travail à mes parents qu’ils trouvent ici toute ma gratitude pour leur soutien tout le long de mes études. A tous ceux qui me sont chèrs Hayet Dédicaces Je dédie ce travail à mes chers parents qui ont été pour moi la force et le soutien dans tout mon cursus estudiantin et qui ont forgé de moi la volonté et l’ambition je vous serais éternellement reconnaissante. Que dieu les protège et leurs donne une vie pleine de bonheur. A mon cher mari RABAH d'être toujours à mes côtés pour me soutenir, pour m'aider dans la mesure du possible, mais surtout pour donner du goût à ma vie par son amour et sa tendresse, j'espère qu'il trouve ici le témoignage de mon profond amour, attachement et respect. A mes frères Amayes et Massinissa pour leur disponibilité, leur soutien moral, leur encouragement incessant. A ma sœur Karima d'être coopératif et d'assumer à ma place certaine de mes responsabilités familiales. A ma belle-famille pour leur soutien, gentillesse et sympathie. A toute ma familles tantes et oncles et a tous mes cousins et cousines A ma meilleur amie Lynda sans oublier mon binôme Hayet …. NASSIMA …. Introduction 1 Liste des figures Figure 1: La vitesse de croissance de quelques microorganismes en fonction du pH Figure 2: Développement des microorganismes en fonction d’activité d’eau Figure 3: Les principales interactions aliment / microorganisme / consommateur Figure 4: La formation de métabolites toxiques à partir de protides Figure 5: Formes optiques de l’acide lactique (SODERGARD et STOLT ,2002). Figure 6: Les deux isomères de l’acide lactique (REZGUI et al., 2008) Figure7 : Structures chimique de la chitine et du chitosane Figure 8: Le procédé d’obtention de la chitine et de chitosane ( ONSOYEN ET SKAUGRUD, 1990) Figure 9: Schéma d’une cellule de THOMAS Figure10: Représentation schématique de la méthode des puits (ZAIKA, 1988) Figure11 : Les zones d’inhibition des souches bactériennes Figure 12 : Effet de l’acide lactique sur E.coli et P. aeruginosa Figure13 : Effet de l’acide lactique sur B. subtillis et S. aureus Figure 14 : Effet de l’acide lactique sur C. albicans Figure15 : Effet de l’acide lactique sur A. niger Figure 16 : effet de chitosane sur E.coli Figure 17 : Effet de chitosane sur B. subtillis, P. aeruginosa et S. aureus Figure 18 : Effet de chitosane sur C. albicans Figure 19 :Effet de chitosane sur A. niger Figure 20 : Effet combiné de l’acide lactique et le chitosane sur les souches bacteriennes Figure 21 : Effet combiné e l’acide lactique et le chitosane sur C. albicans Figure 22 : le test de la CMB pour les bactéries et la levure traité avec l’acide lactique Figure 23 : le test de la CMB pour les bactéries et la levure traité avec le chitosane 2 Liste des tableaux Tableau I : Classification des facteurs d’altération des aliments Tableau II: pH minimum de croissance de quelques germes (Chene, 2002). Tableau III : Les domaines d’application de l’acide lactique Tableau IV: Sources potentielles de chitine (Mathur et Narang, 1990) Tableau V: Activité antimicrobienne du chitosane de quelque microorganismes (Liu et al., 2001) Tableau VI: Les domaines d’application de la chitine et le chitosane (KEDDOU, 2008) Tableau VII: Les échantillons du chitosane selon le temps de traitement avec NaOH Tableau VIII: Effet de l’acide lactique sur les souches bactériennes (méthode des puits) Tableau IX: Effets de l’acide lactique sur les souches microbiennes testées (Méthode des spots) Tableau X: Effets du chitosane sur les souches bactériennes et fongiques Tableau XI: Effet antimicrobien du mélange d’acide lactique et le chitosane sur les souches microbiennes testées Tableau XII : Les valeurs de la CMI pour l’acide lactique et le chitosane 3 Liste des abréviations : CDC Centre américain de contrôle des maladies CMB Concentration Minimale bactéricide CMF Concentration Minimale fongicide CMI Concentration Minimale Inhibitrice COS chitooligosaccharides DD degré de Désacétylation DLC Date Limite de Consommation DLUO Date Limite d'Utilisation Optimale HPLC High-performance liquid chromatography MH Mueller Hinton OMS Organisation mondiale de la santé PPM partie par million TIA toxi infection alimentaire Table des matières Sommaire Liste des figures………………………………………………………………………………..1 Liste des tableaux .......................................................................................................................2 iste des abréviations....................................................................................................................3 Introduction générale..................................................................................................................4 Synthèse bibliographique Chapitre I : Altération microbienne des aliments I. Définition..........................................................................................................................8 II. Origine et nature de la flore microbienne des aliments ....................................................8 III. Les types d’altération microbienne...................................................................................9 IV. Le mécanisme d’évaluation de la flore dans l’aliment ....................................................9 V. Les facteurs d’altération des aliments...............................................................................11 V.1. Les facteurs intrinsèques .....................................................................................................11 V.2. Les facteurs extrinsèques......................................................................................................14 VI. les conséquences...............................................................................................................15 VI.1. incidence sanitaire de la présence de microorganismes ......................................................15 VI.2. les maladies alimentaires.....................................................................................................15 VI.3. Les maladies microbiennes transmises par les aliments ....................................................16 VI.4. Principales flores et germes de contaminations des aliments .......................................18 Chapitre II : Les agents antimicrobiens I. Définition des agents antimicrobiens................................................................................19 II. Types d’agents antimicrobiens .........................................................................................19 II.1. les agents naturels .......................................................................................................19 II.2. les agents synthétiques................................................................................................20 II.3. les agents biologiques .................................................................................................21 II.4. autres agents................................................................................................................21 III. Association d’agents antimicrobiens ................................................................................22 IV. Mode d’action des agents antimicrobiens.........................................................................23 V. Les facteurs influençant l’activité antimicrobienne..........................................................23 VI. Détermination de la sensibilité/résistance des souches microbiennes aux agents antimicrobiens ............................................................................................................24 VII. Détermination de la CMI (concentration minimal inhibitrice) des agents antimicrobiens..26 VIII.Détermination de la concentration minimale fongicide (CMF).....................................26 IX. Aromatogramme avec courbe de concordance.................................................................26 Chapitre III: Mode d’action des agents antimicrobiens naturels : acide lactique et chitosane I. Généralités sur les agents antimicrobiens naturels ...........................................................27 II. L’acide lactique II.1. Définition..................................................................................................................27 II.2. Origine de l’acide lactique........................................................................................28 II.3. La structure de l’acide lactique.................................................................................29 II.4. Les caractéristiques de l’acide lactique ...................................................................29 II.5. Les propriétés de l’acide lactique .............................................................................29 II.6. Mécanisme d’action de l’acide lactique....................................................................31 II.7. Domaines d’utilisation de l’acide lactique................................................................31 III. Le chitosane III.1. Historique .................................................................................................................32 III.2. La Source du chitosane............................................................................................32 III.3. La structure chimique de la chitine et de chitosane..................................................33 III.4. Procédés d’obtention de chitine et de chitosane.......................................................34 III.5. Les caractéristiques du chitosane .............................................................................35 III.6. Les propriétés du chitosane ......................................................................................36 III.7. Le mécanisme d’action du chitosane........................................................................37 III.8. Les applications du chitosane...................................................................................38 La partie expérimentale A. Matériel et méthodes ......................................................................................................39 II.1. Matériel II.1.1.acide lactique ..............................................................................................................39 II.1.2. le chitosane .................................................................................................................39 II.1.2.1.Le protocole d’obtention du chitosane.................................................................39 II.1.3. Les microorganismes ..................................................................................................40 II.1.3.1. Les bactéries ..................................................................................................40 II.1.3.2. Levures ...........................................................................................................40 II.1.3.3. Moisissures ......................................................................................................40 II.2. Méthodes II.2.1. Vérification des souches de référence ...............................................................................41 II.2.1.1. étude macroscopique.............................................................................................41 II.2.1.2. étude microscopique .............................................................................................41 II.2.2. Préparation de la suspension microbienne et des solutions des agents antimicrobiens.....42 II.2.2.1. Préparation de la solution du chitosane ...................................................................42 II.2.2.2. Préparation des solutions de l’acide lactique...........................................................43 II.2.2.3. Préparation de la suspension bactérienne et levure .................................................43 II.2.2.4. Préparation de la suspension de spores....................................................................43 II.2.3. Méthodes utilisées pour détecter l’Effet antimicrobien de chitosane, de l’acide lactique et de leur combinaison ....................................................................................................44 II.2.3.1. la méthode de l’antibiogramme .................................................................................44 II.2.3.2. La méthode des puits .................................................................................................45 II.2.3.3. La méthode des spots.................................................................................................46 II.2.4. Détermination de la concentration minimale inhibitrice ...................................................46 II.2. 5. Détermination des concentrations minimales bactéricides (CMB) ..................................47 B. Résultats et discutions I. La sélection des échantillons du chitosane .......................................................................49 II. Evaluation de l’activité antimicrobienne..........................................................................49 III. Effet antimicrobien de l’acide lactique sur les souches microbiennes .............................52 IV. Effet du chitosane sur les souches microbiennes..............................................................56 V. Effet combiné du chitosane et l’acide lactique sur les souches microbiennes ................60 VI. Les concentrations minimales inhibitrices (CMI) ............................................................64 VII. Les concentrations minimales bactéricides (CMB)........................................................64 Conclusion générale ...................................................................................................................66 Références bibliographiques 4 4 Résumé Cette étude vise d’une part, à évaluer l’activité antimicrobienne de chitosane, principal dérivé de la chitine extraite de la carapace des produits de mer, et de la comparer à celle de l’acide lactique, d’autre part, à déterminer l’effet antimicrobien combiné de ces deux susbtances. L’activité antimicrobienne a été évaluée sur uploads/Geographie/ alteration-pdf.pdf