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République Algérienne Démocratique et Populaire MINISTER DE L’ENSEIGNEMENT SUPE

République Algérienne Démocratique et Populaire MINISTER DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE UNIVERSITE HADJ LAKHDAR -BATNA1- INSTITUT DES SCIENCES VETERINAIRES ET DES SCIENCES AGRONOMIQUES DEPARTEMENT DE TECHNOLOGIE ALIMENTAIRE Licence 3 : « Technologie Agroalimentaire et Contrôle de qualité » Module : Microbiologie Alimentaire Réalisé par : proposé par : 1- BENZINA Nedjla Mme BOUALI.A 2- BELHADI Ikram 3- BENABID Meriem Année Académique : 2020_2021 Introduction: Le contrôle de la qualité microbiologique de nos aliments reste indispensable car il permet d’éviter la commercialisation et la consommation de produits dangereux ou non conformes. Ceci ce fait par des analyses règlementées et régit par normes (nationales ou internationales) qui souvent imposent que l’aliment soit exempte de tous germe pathogène ou de toxine microbienne et que la flore totale soit peu abondante. La qualité sanitaire du produit fini se base sur la numération des germes totaux (FTAM et coliformes totaux) , les germes indicateurs d’une contamination fécale qui sont les coliformes fécaux (souvent associés aux pathogènes tels que : Salmonella et Shigella), Streptocoques fécaux ( ou Entérocoques), les germes indologènes, les germes indicateurs d’une contamination tellurique (sol) comme les anaérobies sulfito-réducteurs ainsi que la recherche des germes ubiquitaires et d’origine humaine ou animales comme Staphylococcus aureus (qui aussi toxinogène). Ces analyses passent par plusieurs étapes dans le laboratoire microbiologiques. Les étapes de test microbiologiques: 1) Matériel : 2) Préparation de dilutions décimales : Dillution d'un aliment liquide : • Homogénéiser la suspension microbienne à prélever. • Ouvrir le tube. • Prélever 1 mL de suspension à l’aide de la pipette plastique stérile. Ne pas introduire la pipette dans la suspension de plus de 1 cm. • Refermer le tube. • Ouvrir le tube de 9 mL de diluant, y introduire le volume prélevé sur la paroi sans toucher le liquide. • Refermer le tube, jeter la pipette souillée dans la poubelle. Dilution d’un aliment solide : Si le produit est solide, on ne peut pas pipeter. L’analyse comprend alors obligatoirement la réalisation d’une suspension de l’aliment broyé dans un diluant. On s’arrange pour que cette préparation corresponde à une dilution au 1/10ème de l’aliment. Pour cela, on broie, par exemple, 25 g d’aliment (de densité approximée à 1 g/mL : 25 mL D’aliment a une masse d’environ 25 g) dans 225 mL de diluant (eau peptonée par exemple). 3) La préparation de milieu de culture : Un milieu de culture est une préparation au sein de laquelle des micro- organismes peuvent se multiplier .il doit donc satistisfaire les exigences nutritives du micro-organisme étudié. Milieux culture :  Préparation nutritive destinée à la croissance de microorganisme en laboratoire  peuvent être liquide ou solides  Milieux synthétiques  Milieux complexes Milieux solide :  milieu liquide auquel on ajoute un agent de solidification tel que l’agar –agar  l’agar –agar est un polysaccharide extrait d’une algue marine  c’est un gel qui est à l’état solide à une T° de moins de 60 °C et qui se liquéfie à 100°C  permet donc l’incubation à des T° élevées  n’est pas une source nutritive pour les bactéries  permet d’obtenir des colonies isolées Milieux liquides :  ces milieux sont la plupart du temps des bouillons nutritifs ordinaires .ils ont trois composants principaux : les peptones, les extraits de viandes et les extraits de levures  les peptones sont des hydrolyses enzymatiques de protéine animales ou végétales riches en acides aminés et en peptides.  les extraits de viandes apportent des sels minéraux, des vitamines, des protéines ; peu de glucides.  les extraits de levure eux représent d’acides aminés et des vitamines . Milieu sélectif :  inhibe la croissance des bactéries indésirables et stimule celle des microbes recherchés  contiennent des agents inhibiteurs (Ab , sel, colorant) Ex : cristal violet et sels bilaires dans la gélose MacConkey Milieux sélectif –différentiel :  posséde les caractéristiques des milieux sélectifs et différentiels Ex : MacConkey Mannitol Salt Milieux d’enrichissement : 1.milieu liquide :  donne des conditions favorables à la croissance d’un seul microbe donné ce qui en favorise la multiplication Ex : milieu sélénite utilisé dans les spécimens de selles pour favoriser la croissance des salmonelles et des shigelles au détriment des autres bactéries présentes . 2.Milieux différentiel :  facilite la distinction entre les colonies de la bactérie recherchée et les autres colonies présentent sur le même milieu. Gélose Mannitol Salt composition :  extrait de bœuf  peptones  NaCL 7.5 :élélent sélectif  Mannitol : élément différentiel  rouge de phénol : indicateur de pH  utilité : isolement des bactéries halophiles comme les staphylocoques. 4) Ensemencement : Un ensemencement en masse est le plus souvent réalisé afin de dénombrer des micro-organismes. Un volume de 1 mL d’inoculum est dispersé dans le fond d’une boite de Pétri, et le milieu de culture est ensuite coulé par-dessus.  Techniques de l’ensemencement : L’ensemencement consiste à déposer dans un milieu neuf des germes prélevés dans un milieu de culture mère. Le transport est en général effectué avec une anse ou une pipette Pasteur. 1 /Ensemencement avec une anse :  prendre les précautions nécessaires pour travailler dans de bonnes conditions d’aseptie (nettoyage paillasse, mains ...)  veiller à travailler dans la zone stérile autour du bec Bunsen  tenir le tube contenant la culture mère dans la main gauche, déboucher près de la flamme et garder le coton dans la main.  flamber l’ouverture du tube.  stériliser l’anse en le portant au rouge dans la flamme du bec Bunsen, la laisser refroidir dans la zone stérile.  prélever et repiquer rapidement dans le tube contenant le milieu de repiquage : *repiquage dans un milieu liquide : repiquer ce qui est prélevé à l’intérieur de la boucle *repiquage sur milieu solide: repiquer en déplaçant en zig zag l’aiguille sur la surface de l’agar, du fond du tube vers l’ouverture, en prenant soin de ne pas érafler la gélose .  repasser dans la flamme l’aiguille à ensemencer en le portant au rouge. L’aiguille est prête pour un nouvel ensemencement.  flamber l’ouverture des tubes, flamber légèrement les cotons, boucher . 2 / Technique d'ensemencement avec la pipette Pasteur : Les manipulations se différencient des précédentes par quelques détails :  la pipette est passée rapidement dans la flamme.  l'effilure est cassée à la pince dans la zone stérile.  on aspire les bouillons de culture (éviter que le bouillon de culture souille le coton, danger d'infection pour le manipulateur, pas plus que la salive du manipulateur, danger d'infection pour la culture)  on souffle pour ensemencer dans le tube stérile  La pipette ne sert q’ une fois 5) Isolement : Pour étudier les microorganismes ; il est indispensable de les isoler et d’en faire une culture pour deux techniques sont alors utilisées : _la méthode des strie _la méthode des dilutions  méthode des stries : cas d’un ensemencement en surface à partir d’un prélèvement liquide ou solide : -prendre les précautions habituelles pour un ensemencement (n’ouvrir que le temps nécessaire à l’exécution des strie et n’entrebâiller alors la boite que devant un bec bensen ) -porter l’anse au rouge dans la flamme du bec ; la laisser refroidir dans la zone stérile et avec l’autre main entrouvrir la boite de culture (solide) ou le tube (liquide ) -prélever une colonie ou une goutte de suspension avec l’anse ,refermer la boite ou le tube et prendre la boite vierge -ensemencer de la façon suivantes : -partir de 1 en ensemençant selon le sens des flèches jusqu’à vers 2.flamber l’anse ;la laisser refroidir et repartir perpendiculairement à la direction précédente 1- 2jusqua vers 3. -les boites de pétri sont lises en position renversée à30°C.observer après 24à48heures selon le cas (la position renversée permet à l’eau de condensation de s’évaporer ). Coloration de gram : c’est la coloration de base en bactériologie qui permet de distinguer les bactéries en gram positif et en gram négatif ;cette distinction est fondamentale pour leur identification .en effet ;le violet de gentiane se fixe sur des composants cytoplasmiques et après ce temps de coloration ; toutes les bactéries sont violettes .chez les bactéries à gram négatif ;la paroi ,riche en lipides ,laisse passer l’alcool qui décolore le cytoplasme alors que ;chez les bactéries à gram positif ;ma paroi constitue une barrière imperméable à l’alcool et le cytoplasme de leur coloré en violet . Les Entérobactéries: . Caractères généraux du groupe : Les membres de la famille des Enterobacteriaceae se trouvent comme parasites, parfois pathogènes ou commensaux chez l'homme et autres animaux, et comme saprophytes dans le sol et les eaux. Ils sont très répondus dans la nature en raison de la contamination de l'environnement par les matières fécales animales et des eaux d'égouts. Ce sont des contaminants alimentaires très fréquents. Certains sont dangereux et peuvent être à l'origine d'intoxications. Cette famille comprend des bacilles Gram-, non sporulant, anaérobies facultatifs, mobiles (le plus souvent flagellés péritriches) ou non, isolés ou par paires. Chimioorganohétérotrophes, croissent habituellement uploads/Geographie/ les-travaux-pratiques-de-microbiologie-alm.pdf