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Introduction : Les actinomycètes constituent l’ordre des actinomycétales. Ce so

Introduction : Les actinomycètes constituent l’ordre des actinomycétales. Ce sont des bactéries filamenteuses, septées, ramifiées, prenant généralement le Gram (Larpent et al., 1989), le mot «Actinomycètes» provient de deux substantifs grecs « Actino » et « Mycète » et signifie «champignons à rayon» ou «champignons rayonnants», expression utilisée pour désigner en anglais (Ray fungi) et aussi en allemand et en russe (Loqman, 2009). Elles croissent en l’espace de quelques jours à quelques semaines. Elles sont abondamment distribuées dans la nature. Les actinomycètes sont importants en raison surtout de leur rôle dans la fertilisation des sols, synthèse de composés complexes comme les antibiotiques, les vitamines, les stérols. Ces microorganismes, en effet, présentent des similitudes à la fois avec les Eubactéries et avec les champignons. Il existe d’ailleurs toute une série de formes de transition entre les formes mycéliennes typiques et les formes unicellulaires présentant une aptitude peu marquée à former un mycélium ramifié (Dommergues et Mangenot, 1970), Ils sont sensibles à certains antibactériens mais pas aux antifongiques(Aouar,2006). Certains actinomycètes sont capables de se développer à des températures élevées et de produire des enzymes actives dans des conditions acides (Ensign et al., 1993). Quelques espèces d'actinomycètes sont des symbiotes de plantes (Larpent et Larpent- Gourgaud, 1985). Le terme d’actinomycète a été utilisé pour la première fois par Bollinger, en 1877, pour désigner l’agent responsable d’une maladie du bétail, Cette période a été nommée « période médicale » du fait que l’intérêt porté à ces microorganismes était dû presque exclusivement aux propriétés pathogènes qu’on leur attribuait (Baldacci, 1962).La seconde période (1900-1940) (Mariat et Sebald, 1990)se rapporte à la mise en évidence et à l’étude des actinomycètes du sol, avec les travaux de Rossi-Doria(1890-1891), Waksman(1919), Lieske(1921), Jensen(1931-1933). Elle couvre la découverte des conditions saprophytiques d’habitat des actinomycètes et les premières tentatives pour distinguer deux groupes : les pathogènes et les saprophytes.L’époque suivante est celle de la découverte l’actinomycine par Wacksman en 1940 à partir d’une culture de Streptomycesantibioticus(Wacksman et Woodruff, 1940) et de la streptomycine chez Streptomycesgriseus(Shartzetal.,1944).Ainsi, la période suivante (1940-1970) peut être définie comme une période de développement de critères morphologiques et biochimiques pour la classification des actinomycètes, en parallèle avec la meilleure compréhension de la physiologie de ces bactéries deleur intérêt pour la production de métabolites secondaires et leur potentialité de biodégradation de composés organiques. Les actinomycètes ont souvent été confondus avec des champignons du fait de leur morphologie fongoïde (présence de filament ramifiés, sporulation) (Reponenetal., 1998), ainsi que de l’allure mycosique des maladies que certains provoquent (Gazenko etal., 1998), mais leurs propriétés chimiques, physiologiques, et immunologiques les rangent parmi les procaryotes. Leurs paroi cellulaire ne renferme ni chitine ni cellulose mais une glycoprotéine contenant de la lysine (formes fermentatives) ou de l’acide diaminopimélique (formes oxydatives), et leur cytologie est celle des bactéries (Mariat et Sebald, 1990). Ces caractères s’ajoutant à d’autres (leurs parasitage par des bactériophages, leurs sensibilités aux antibiotiques, antibactériens) ne permet pas de les classer parmi les mycètes (Hasley et Leclerc., 1993). Matériel : Isolement des actinomycètes du sol : Prélèvement du sol Les échantillons de sol ont été prélevés selon la technique de Pochon et Tardieux (1962) À, l’aide d’une grande spatule stérile, les cinq premiers centimètres de la couche superficielle du sol sont écartés, on prélève alors avec une petite spatule stérile dans la couche sous-jacente (entre 5 et 15 centimètres de profondeur) 100 à 150 grammes de terre qui sont déposés sur une feuille d’aluminium stérile. Les gros débris sont écartés (pierres, racines, etc.) et environ 50 grammes sont placés dans un flacon stérile et transportés le plus rapidement possible au laboratoire. Prétraitement du sol Plusieurs techniques de prétraitement des échantillons du sol, ont été appliquées dans les différents programmes de screening des actinomycètes dans le sol, ils ont tous comme objectifs à faciliter l’isolement sélectif des actinomycètes, qui ont une croissance lente, par rapport aux bactéries et aux champignons, qui gênent par leurs croissances rapides. Afin d’augmenter le rapport actinomycètes/microorganismes, trois stratégies sont suivies:  Prétraitement chimique ou physique comme : l’utilisation des agents sporosides (phénol, gluconate de chlorhexidine et le chlorure de benzéthonium ) (Thiemann, 2012) ; le chauffage des échantillons du sol (Baskaran et al., 2011), la centrifugation, séchage...etc (Yamamura et al., 2012). Par exemple le phénol on ajoute 0,1 ml d'une suspension dense de sol à 10 ml de phénol à 1,4%. Après 10 minutes, on dilue la suspension et on l’étale sur la plaque. On observe l'élimination plus ou moins importante des bactéries et des champignons sans trop abîmer les actinomycètes. Les avis sont partagés à propos de cette technique dont les résultats sont aléatoires.  Utilisation dans le milieu de culture de certaines sources de carbone ou d’azote qui rende le milieu plus sélectif pour l’isolement des actinomycètes, comme : caséine, chitine, amidon, glycérol, asparagine…etc.).  Utilisation des antibiotiques qui empêchent la croissance des bactéries et les champignons (Zhang, 2011). Le séchage des échantillons du sol à l’air libre pendant sept jours, a pour but la réduction de la flore bactérienne contaminante. En effet les conidiospores des actinomycètes résistent bien à la dessiccation par rapport aux autres bactéries de coloration de Gram positif et négatif qui vont crever (Khanna et al., 2011). Les travaux de Fan et al, (2010), indiquent qu’un séchage des échantillons du sol pendant 7 à 21 jours réduise considérablement le nombre des champignons ainsi que les bactéries. De plus on a utilisé des milieux sélectifs on ajoutant les antibiotiques. Techniques d'enrichissement et d'isolement des Actinomycètes : L’enrichissement des actinomycètes dans le sol se fait par l’addition du carbonate de calcium (CaCO3) et par l’addition de chitine ou de kératine. - par addition de CaCO3 : on mélange 1 g d'un échantillon de sol séché à l'air avec 0,1 g de CaCO3. Le mélange est incubé à 26°C pendant 7 à 9 jours dans une atmosphère saturée d'humidité. Le nombre de colonies de Streptomycètes obtenues est 100 fois supérieur au nombre de colonies de Streptomycètes dans un échantillon témoin (non traité) ; - par addition de chitine ou de kératine : l'addition de chitine ou de kératine conduit également à une augmentation de colonies des Streptomycètes. L’addition du carbonate de calcium affecte négativement la flore fongique et élimine la plupart des bactéries par le séchage de l’échantillon. L'addition de chitine ou de kératine affecte positivement le nombre de bactéries. L'incubation en condition humide conduit à une augmentation jusqu'à 1.000 fois le nombre de colonies de Streptomycètes. Les ensemencements sont effectués par la méthode de suspension-dilutions. On met en suspension 10g du sol sec dans 90 mL d’eau physiologique stérile (NaCl 9 g.L-1 ), ce qui représente la dilution 10-1 . Après homogénéisation au vortex, on réalise des dilutions décimales dans l’eau physiologique stérile jusqu’à 10-9 (Kitouni, 2007), puis on étale 100 µL de chaque dilution à la surface des milieux de culture : Milieu Chitine-vitamines B - Milieu Olson- Milieu Bennett - Gélose Trypticase de Soja (T.S.A). Tous les milieux utilisés dans cette étude contiennent des antifongiques : le cycloheximide (50 µg/mL) (Belyagoubi, 2014) et la nystatine à une concentration de (50 μg/mL) sont les antifongiques les plus utilisés comme additifs dans les milieux d’isolements des actinomycètes (Dulaney et al., 1955 ; Porter et al., 1960) et l' acide nalidixique (10µg/ml) (Aouar, 2006). Après ensemencement, les boites sont incubées à 28±1°C pendant 2 à 4 semaines et examinées régulièrement. Les colonies qui présentent les critères des actinomycètes sont repiquées et purifiées sur le milieu Bennett. Milieux d'isolement des Actinomycètes : - Milieu de Bennett : Glucose 10 g Extrait de levure 2 g Peptone 2 g Extrait de viande 1 g Agar 20 g Eau distillée 1.000 ml pH 7,3 Examens microscopique et macroscopique : Macromorphologie et caractères culturaux L’aspect phénotypique de la colonie et les caractères culturaux sont déterminés sur le milieu Bennett. Les inoculums sont ensemencés par la méthode de stries. Après 14 jours d’incubation à 28±1°C, l’importance de la croissance et le développement du mycélium aérien sur chaque milieu sont observés. La pigmentation du mycélium aérien et celui du substrat (le dos de la colonie) et la présence de pigments diffusibles dans la gélose autre que les pigments mélanoïdes sont notés (Shirling et Gottlieb., 1966). Observation microscopique Technique de culture sur lamelle (Williams et Cross., 1971 ; Holt et al., 1994), qui consiste à insérer délicatement une lamelle stérile dans un milieu gélosé Bennett de telle sorte qu’elle forme un angle de 45° avec celui-ci. Une goutte de chaque inoculum est déposée contre la lamelle en contact avec le milieu nutritive. Après 14 jours d’incubation à 28°C, la lamelle est retirée soigneusement de la gélose entraînant quelques fragments du mycélium, elle est ensuite déposée sur la lame et examinée au microscope optique à différents grossissements. Critères morphologiques d’identification : La systématique des actinomycètes est basée sur trois types de critères : morphologiques, physiologiques et chimiques. La morphologie est l’un des critères essentiels d’identification, elle précède l’étude chimique des constituants cellulaires. Les propriétés culturales et morphologiques sont déterminées par les méthodes décrites dans le « uploads/Histoire/ expose-indu.pdf