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LICENCE BIOLOGIE FONDAMENTALE Section SV6 PARCOURS : BIOTECHNOLOGIES ET AMELIOR

LICENCE BIOLOGIE FONDAMENTALE Section SV6 PARCOURS : BIOTECHNOLOGIES ET AMELIORATION DES PLANTES "BAP" TRAVAUX DIRIGES GENOMIQUE DES EUCARYOTES M. AIT HAMZA Année universitaire 2019/2020 1 Exercice 1 : La séquence d’ADN ci-dessous concerne un fragment de 120 nucléotides de la séquence codante du gène spoIIG de Bacillus subtilis 5 'P GAAAAAACTG AAATTACGGT TGACGCACCT CTGGTATAAG CTGCTGATGA AACTTGGGCT GAAAAGTGAT GAAGTCTATT ACATAGGCGG GAGTGAAGCC CTGCCGCCTC CATTATCTAA 3'OH a) la protéine codée par le gène entier fait 26400 Da. Quel pourcentage de la protéine représente la partie codée du fragment ? Le fragment est constitué de 120 nucléotides, et donc de 40 codons (3 nucléotides par codon). On aura donc 40 acides aminés à partir de cette séquencé. Or on sait que l'on a en moyenne 110 Da par acide aminé. On aura donc: PM = 110 x 40 = 4 400 Da soit 4,4 kDa On peut donc calculer le pourcentage : Pourcentage= 4 400 / 26 400 x 100 = 16,7 % b) le tableau ci-dessous concerne 18 nucléotides du fragment de 120 nucléotides de la séquence codante du gène spoIIG de bacillus subtilis. Compléter le tableau d la façon suivante ; Indiquez, sur chaque ligne, au niveau des colonnes A et H s’il s’agit d’une extrémité 3’ ou bien 5’, ou bien C-ter ou bien Nter. Justifiez votre réponse. Complétez les nucléotides manquants. Justifiez ce que vous porterez dans chaque case. Ext A B C D E F G H Ext ADN brin a 5’ TTT CAT CAG CAG CTT ATA CCA GAG 3’ ADN brin b 3’ AAA GTA GTC GTC GAA TAT GGT CTC 5’ ARNm 3’ AAA UUA GUC GUC GAA UAU GGU CUG 5’ Anticodons ARNt 5’ TTT CAT CAG GAG GUG ATA CCA GAG 3’ Acides aminés Ct Lys Met Leu leuc LYS TYR TRP Leu Ht Exercice 2 : Le schéma ci-dessous illustre le principe de la méthode de séquençage de l’ADN des didésoxynucléotides (ou terminateurs de chaines). On rappelle que cette méthode est basée sur l’incorporation aléatoire d’analogues des désoxynucléosides triphosphates (les diésoxynucléotides triphosphates) dans les brins néosynthétsés par l’ADN polymérase. La chaine d’ADN monocaténaire est schématisée dans le sens 3’5 ; le détail de sa séquence est donnée ans la partie où est initiée la réaction de polymérisation. L’amorce est schématisée par une ligne noire. a) Donner la séquence de l’amorce utilisée en précisant bien les extrémités 5’ et 3’ ? La séquence de l‘amorce utilisée : 5' TTAGCACGACTACAAGAG3' Cette séquence est le complémentaire du brin matrice. 2 Ainsi la lecture de la séquence correspondra à la complémentaire de la matrice L’électrophorèse est réalisée à PH7 en présence d’urée 6M. On supposera que le produit le plus rapide, indiqué par une flèche sur l’auto-radiogramme ci-dessous et schématisé sur la partie gauche correspond à l’amorce additionnée du 1er nucléotide G. b) Lire la sequence en precisant les extremites 5' et 3'. En bas du gel correspond les fragments les pluspetits, donc il faut lire de bas en haut. En regardant dans quelle colonne se trouve le fragment de taille légèrement supérieur et done le nucléotide suivant. Si le premier correspond à l'amorce + G, la polymérase, polymérise de 5' vers 3' La séquence de I'amorce plus le reste: 5' TTAGCACGACTACAAGAGGCATATGCACGCGCATA3' Donc la séquence de I'ADN est le complémentaire soit: 3' CGTATACGTGCGCGTAT 5' Qui se représente sous la forme 5' vers 3' soit: 5' TATGCGCGTGCATATGC 3' 3 Exercice 3 : Deux ADN doubles brins A et B d’origine différente sont constitués de 647 pb. L’ADN est résistant à l’action des exonucléases tandis que l’ADN B est hydrolysé par ces enzymes. 1) Quel est le poids moléculaire exprimé en Dalton de ces ADN ? Une des caractéristiques de la double hélice est qu'un ADN double brin d'1kb (soit 1000 pb) a un poids moléculaire de 6,6.105 Da, soit 660 kDa. On peut donc calculer le poids moléculaire pour nos deux ADNs : PM = 6,6.105/1000 x 647 = 4,27.105Da = 427 kDa 2) Donner en µm la longueur de ces ADN ? L'autre caractéristique de la double hélice est qu'un ADN double brin d'1 kb (soit 1000 pb) a une longueur de 340 nm. On peut donc calculer la longueur de nos deux ADNs : 1= 340 /1000 x 647 = 220 nm 3) pourquoi l’ADN A est-il insensible à l’actoion des exonucléases ? Les exo-nucléases coupent l'ADN au niveau des nucléotides terminaux. Elles ne coupent donc que I'ADN linéaire. L' ADN A étant insensible à ces enzymes, il s'agit donc d' ADN circulaire. On chauffe des solutions des ADN A et B et on mesure leur absorbonce à 260 nm en fonction de l’élévation de témpérature. Les résultats sont présenyés sur la figure n)1. 4) Pour quelle raison l’absorbance est-elle mesurée à 260 nm ? Car l'ADN absorbe dans les UV et présente un maximum d'absorbance a 260 nm. 5) Que signifient les différences enregistrées pour les ADN A et B à 40°C ? La loi de Beer Lambert lie l'absorbance a la concentration en effet A = e. I. c. 4 La différence observée entre A et B à 40°C nous indique donc que la solution d' ADN A est moins concentrée que la solution B. 6) Que traduit l’augmentation de l’absorbance lorsque la température s’élève ? On sait que I'ADN se dénature quand la température augmente. A une température particulière, appelée Tm, les deux brins se séparent, et on passe donc d'un mélange d' ADN double brin a un mélange de deux brins d' ADN monocaténaire. Or l’ADN monobrin absorbe plus que l’ADN double brin. D'où l'augmentation d'absorbance quand la température augmente. On peut d'ailleurs déterminer la Tm en observant le graphique . 7) En quoi les 2 ADN différent-ils ? L’ADN C, linéaire mesure 0,3 µm et a un poids moléculaire de 291000 Da. Les deux courbes présentent un profil similaire. Cependant, la courbe A est toujours inferieure à celle de B, ce qui traduit une concentration plus faible. Debplus l'augmentation de l‘absorbance est observée plutôt pour A que pour B. L'ADN A semble avoir un TM de 65°C. La TM dépend de la composition de I'ADN et surtout du pourcentage de A+T et de G+C. On peut donc en déduire que I'ADN B contient plus de G+C que I'ADN A (qui contient donc plus de A+T que B). Pour résumer on sait donc que: - la solution de A est moins concentrée que celle de B - les compositions des ADN A et B diffèrent - I'ADN B contient plus de G+C que l'ADN A Des préparations des trois ADN sont soumises à une électrophorèse sur gel d’agarose. Le profil de migration est présenté sur la Figure suivant : 8) Indiquer sur la figure l’emplacement et la polarité des électrodes. L' ADN porte de nombreuses charges négatives, il migre donc de l’électrode vers l'électrode +, comme indique ci-dessous : Electrode - en haut électrode + en bas du schéma. 9) La distance parcourue par L’ADN C est-elle compatible avec les paramètres précédemment calculés ? L'ADN C fait environ 900 bases, on aurait donc pu s'attendre à une voir une bande plus haute que celle des ADN A et B (qui font 647 pb). En effet, plus un fragment est long, mains il migre. Mais I'ADN C est monobrin, ce qui explique qu'il migre plus vite qu' A 5 et B. En effet les ADN simple brin migrent plus loin que les ADN double brin de même taille 10) Pourquoi observe-t-on deux bandes avec L’ADN A ? L'ADN A présente 2 bandes car il s'agit d'un ADN circulaire. On observe donc une bande correspondant à I'ADN relaxé (celle du haut) et une pour I'ADN surenroulé (celle du bas). Ces deux bandes confirment donc qu'il s'agit bien d'un ADN circulaire, ce que l’insensibilité aux exo-nucléases avait montré. 11) Il est possible de convertir la forme la plus rapide de cet ADN en la forme la plus lente. Comment ? Oui, on peut convertir la forme rapide en forme lente. Il suffit de forcer L'ADN circulaire à passer de sa forme surenroulée à sa forme relaxée, Pour cela il suffit de faire une coupure sur l'un des brins en utilisant une topo isomérase, 12) Il est possible de convertir les deux formes de cet ADN en une forme qui migrerait au même niveau que l’ADN B. comment ? L'ADN A et B ont la même taille, ils devraient donc migrer a la même hauteur. Mais I'ADN B est linéaire alors que I' ADN A est circulaire. Donc pour que A migre de la même manière que B, il faut le linéariser et donc faire une coupure sur les deux brins. Pour cela on pourra utiliser une endonucléase. 6 Sujet 1 : Certaines bactéries ont développé avec le temps des stratégies variées pour résister aux antibactériens. C’est notamment ce que l’on constate avec l’émergence de nombreuses souches bactériennes résistantes aux antibiotiques. L’une des stratégies de ces bactéries consiste à exprimer à leur membrane plasmique des protéines, appelées transporteurs d’efflux multi-spécifiques, réalisant le transport vers le milieu uploads/Litterature/ genomique-corrige.pdf