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Les prélèvements EN BIOCHIMIE Les prélèvements EN BIOCHIMIE Le prélèvement de l

Les prélèvements EN BIOCHIMIE Les prélèvements EN BIOCHIMIE Le prélèvement de l’échantillon à analyser est le premier échelon de toute analyse, les analyses biochimiques portent le plus souvent sur le sang total, sérum), les urines, divers liquides (LCR, liquide pleural,..) ou biopsie. 1)-Sang 1)-Sang veineux veineux a-Modes de prélèvement Le prélèvement est effectue au niveau des veines superficielles du pli du coude a l’aide d’une aiguille bien coupante en acier inoxydable et ce après avoir placer un garrot afin que la circulation artérielle ne soit pas arrêtée. L’aiguille est montée sur une seringue mais elle doit se remplir d’elle même sans tirer le piston. Enfin, le sang prélève est reparti sur des tubes spéciaux selon l’examen demande. b-Conditions de prélèvement Le prélèvement doit répondre à certaines conditions : - Il doit être effectue le matin et a jeun afin d’éviter les variations nycthémérales, en général un jeun de 3a 10 heures suffit. - Le sujet doit être en état de repos ; allonge ou détendu. - Il faut rassurer le patient et le placer dans un endroit confortable et éviter toute émotion (variation de la concentration du glucose, acide gras, phosphate sous l’influence des décharges d’adrénaline). c-Matériels de prélèvement : - Le matériel doit être sec et propre (aiguille, seringue, tube, bouchon). - Le sang ne doit pas être trituré ni secoué brutalement mais agiter par simple retournement dans un tube bouche. - Eviter toute hémolyse qui empêche la réalisation de nombreux dosages sur le sérum et plasma. d- Les récipients : Tubes en verre ou en plastique (polyéthylène),munis d’un bouchon adapte. Pour l’identification de échantillon, on lui attribut un numéro qui est propre au sujet, ce qui facilite par la suite les enregistrements. e-Les anticoagulants : L’anticoagulant permet d’obtenir après centrifugation du sang, le plasma avec son fibrinogène(+ culot globulaire). Les principaux anticoagulants sont : EDTA, héparine, citrate. En absence d’anticoagulant, le sang coagule en quelques minutes, et après centrifugation, on sépare le sérum sans fibrinogène (caillot de fibrine contient les éléments figures). Le sérum ne peut plus alors coaguler ce qui est préférable pour les pipetes et les automates afin d’éviter le bouchage des micro-tubules. 2) 2) Prélèvement d'urines : Prélèvement d'urines : a. Prélèvement : - Urine de 24 h : La collecte des urines de 24h est très utile mais on est confronté à un problème de stockage et de conservation du fait de l'importance du volume recueilli. Les urines de 24 h sont utilisées principalement dans la détermination de glycosurie, de la créatininurie et de l'albuminurie de 24 h. La collecte de ces urines de 24h par diurèse spontanée doit respecter certaines conditions, à savoir : - Faire uriner le sujet à 8h du matin puis jeter ces premières urines et recueillir toutes les urines jusqu'au lendemain 8h du matin. - Recueillir sur récipient propre (bouteille d'eau minérale par exemple) - Conserver dans un endroit frais. On mesure la diurèse après homogénéisation de l'échantillon. - Echantillon urinaire unique : La confection de l'échantillon unique nécessite une standardisation car la composition des urines varie selon l'heure du jour, l'activité et l'état du sujet. En général, il faut recueillir les urines à une heure fixe le matin et, si possible, utiliser le même procédé que celui des urines de 24h pour recueillir les urines émises en une heure. N.B ! Les urines sont utilisées à des fins analytiques, pour l'établissement de bilans d'exploration rénale le plus souvent. Centrifugation Centrifugation Le sang doit être centrifuge le plus rapidement possible après le prélèvement. La centrifugation est utilisée généralement pour précipiter les éléments cellulaires contenus dans un liquide normal ou pathologique Le but de la centrifugation du sang prélevé sur un anticoagulant est l’obtention du plasma. Le but de la centrifugation d’un sang prélevé sur un tube sec est l’obtention du sérum. Pour obtenir le plasma ; on centrifuge pendant 3 minutes a 3000-5000 t/min, pour une centrifugeuse ordinaire, il se forme une couche inférieure constituée des éléments figures, le plasma surnage. Pour séparer le sérum ; décoller le coagulum des parois de verre a l’aide d’une fine baguette et centrifuger, le sérum peut aussi être sépare après rétraction du caillot quelques heures a 37ºC. Les tubes sont places dans les portoirs de la centrifugeuse de façon équilibrée et sont soumis à un mouvement de rotation rapide. Après centrifugation on décante immédiatement le sérum ou le plasma dans un ou plusieurs tubes correctement étiquetés. Le plasma et le sérum peuvent être conserves dans des tubes bouches plusieurs jours a +4ºC, congelés a -20ºC. N.B ! La plupart de leurs constituants se conservent indéfiniment. On prépare ainsi les sérums de contrôle. BILAN LIPIDIQUE Etant hydrophobes, les lipides ne peuvent circuler dans le sang que s’ils sont lies a des polypeptides appelés Apoprotéines. Un bilan lipidique ne peut être effectue que sur un tube sec contenant un sérum provenant d’un sujet a jeun depuis 12 heures. Ce bilan lipidique comprend : 1. Aspect du sérum : Pouvant être ; clair, opalescent, lactescent. L’aspect du sérum représente un grand intérêt, chez un sujet normal, l’aspect du sérum : Apres centrifugation clair. Apres conservation 24 heures a +4ºC clair 2. Dosage des lipides :  Cholestérol total : test enzymatique, colorimétrique.  Triglycérides : dosage colorimétrique et enzymatique. 3. Analyse des lipoprotéines :  Cholestérol HDL.  Electrophorèse des lipoprotéines sur acétate de cellulose.  Apo AI , ApoB A-Dosage du cholestérol : Généralités : Le cholestérol est un stéroïde possédant un groupe hydroxyle secondaire en position C3. Il est synthétise dans de nombreux tissus, en particulier dans le foie et la paroi intestinale. Les trois quarts environ du cholestérol sont synthetisés dans l’organisme et un quart est apporté par l’alimentation. Les dosages du cholestérol sont utilises pour le dépistage d’un risque d’athérosclérose, Ainsi que pour le diagnostic et le traitement de maladies avec taux de cholestérol élevé Et de troubles du métabolisme des lipides et des lipoprotéines. Principe : Test colorimétrique enzymatique. L’addition, à l’échantillon, du réactif R1 (réactif cholestérol) conduit au déclenchement de la réaction ; La concentration en cholestérol est déterminée par voie enzymatique a l’aide de cholestérol-estérase et de cholestérol –oxydase, l’indicateur quinonemine est formé à partir du phénol et la peroxydase. *Cholestérol estérifié + H2O cholestérol estérase cholestérol + acide gras Cholestérol oxydase * Cholestérol + O2 cholestène-4-one-3 + H2O2 Peroxydase *2H2O2 + phénol + 4 AAP quinonèimine + 4H2O AAP : amino-4-antipyrine. Quinoneimine est un dérivé de coloration rose, l’intensité de la coloration developpée est directement proportionnelle à la concentration en cholestérol, et est mesurée par spectrophotométrie.  Composition des réactifs Réactif 1 : Tampon Pipes pH 6.90 ………………. 50mmol/l Phénol ……………………………….. 24mmol/l Cholate de sodium ……………………. 0.5mmol/l Réactif 2 : Amino-4-antipyrine …………………… 0.5mmol/l Cholestérol estérase …………………… ≥ 200U/l Cholestérol oxydase ………………….. ≥ 250U/l Peroxydase ……………………………. ≥ 1000U/l  Etalon : Cholestérol 2g/l (200mg/dl =5.17mmol/l).  Stabilite des réactifs : Les réactifs sont conservés à 2-8°C et à l’abri de la lumière.  Réactifs de travail : préparation - Dissoudre le réactif 2 avec le réactif 1. - Attendre environ 15mn avant utilisation. - La solution obtenue peut être conservée pendant une semaine à 20-25°C et 3mois à 2-8°C.  Echantillons : Sérum. Plasma recueilli sur héparine.  Valeurs normales : 1.50 – 2.60 g/l 150 – 260 mg/dl 3.87 – 6.71 mmol/l  Mode opératoire : La méthode ci-dessous est la méthode manuelle pour spectrophotométrie. Ce réactif peut être utilise pour la plus part des automates. Blanc Etalon Dosage Réactif du travail 1ml 1ml 1ml Eau distillée 10µl _ _ Etalon _ 10µl _ Echantillon _ _ 10µl Longueur d’onde : 500 nm Température : 37ºC. Cuve : trajet optique 1cm. Zéro de l’appareil : blanc réactif Mélanger et lire la densité optique Do après 5mn d’incubation. La coloration finale est stable au moins 1h.  Calcul : (Do dosage / Do etalon) x n. g/l n = 2 mg/dl n = 200 mmol/l n = 5.17 n = concentration de l’étalon.  Performances : Linéarité : Le réactif est linéaire jusqu’à 5g/l en méthode manuelle (500mg/dl) (12.9mmol/l). Si la concentration en cholestérol est superieure a 5g/l, diluer échantillon au ½ avec une solution de NaCl a 9g/l et refaire le test. Limite de détection : Détermination selon le protocole recommandé par Vassault et Coll. , la limite de détection est égale a 30mg/l. Sensibilité : La sensibilité fonctionnelle est égale à 100mg/l.  Interférences : Selon les recommandations de la SFBC, diverses substances sont ajoutées, en quantités croissantes, à un pool sérique humain frais de titre normal ou pathologique. Les tests montrent que les triglycérides, le glucose, l’acide ascorbique et l’hémoglobine n’interfèrent pas aux concentrations testées (triglycérides jusqu’à 5g/l, glucose jusqu’à 10g/l, acide ascorbique jusqu’à 50mg/l et hémoglobine jusqu’à 5g/l). Variations physiopathologiques : Variations physiologiques : - La concentration en cholestérol varie avec l’age. - Elle est plus élevée chez l’homme que chez la femme. - Varie en fonction des exercices physiques, régime alimentaire et pendant la grossesse. Variations pathologiques : 1- les hypercholestérolémies Toutes dominées uploads/Management/ biochimie-pratique.pdf