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MÉTHODES D’IDENTIFICATION DES MICROORGANISMESChapitre II Dr. Adel Aouiche Modul

MÉTHODES D’IDENTIFICATION DES MICROORGANISMESChapitre II Dr. Adel Aouiche Module :Microbiologie alimentaire - 3eme année Ecole supérieure des Sciences de l’Aliment et des Industries Agroalimentaires ESSAIA - Alger Plan général du chapitre 1- Connaissances fondamentales sur les approches taxonomiques 2- Etude bactériologique de quatre groupes bactériens (entérobactéries, Pseudomonas, Staphylococcus, Streptococcus) 3- Plan général d’identification des bactéries 4- Tests d’orientation 5- Galerie classique (tests biochimiques, physiologiques et sérologiques) 6- Galerie Api ou galerie rapide (API20 E, API20 NE, API Stph, API Strep) 7- Identification phylogénétique (étude moléculaire ) 8- Identification par Maldi-Tof (technique phénotypique moléculaire ultra précise) CONNAISSANCES FONDAMENTALES SUR LES APPROCHES TAXONOMIQUES Sous chapitre 01 Evolution Intérêts de la taxonomie Approche phylogénétique Approche numérique Approche phénotypique Approche métagénomique Approche polyphasique Notion d’évolution 4 L’évolution est définie comme un phénomène naturel ou les espèces vivantes subissent des modifications au cours du temps, conduisant à l’apparition de nouvelles espèces. Modifications Visibles (génotypique et phénotypique) ou pas (génotypique seulement). C’est pour cela que deux individus peuvent se ressembler phénotypiquement mais appartiennent à deux espèces différentes. Notion d’évolution ATTCG AATCC AATCG TTTCG A=>T G=>C T=>A Ressemblance +++ Ressemblance + 5 L’évolution est donc toujours une histoire de modification génotypique (mutation génétique) au cours du temps sous l’influence de certains facteurs. Mutation génétique >> Modification du génome >> Evolution du génome >> Evolution des espèces vivantes >> Apparition d’espèces nouvelles Evolution des génomes – Mutations et transferts des gènes Délétions de nucléotides >> mutations délétères Insertions de nucléotides Transfert des gènes 6 Une mutation est un changement spontané ou induit par certains facteurs mutagènes (ex: Ultraviolet, agents chimiques mutagènes….) qui modifie une séquence nucléotidique au niveau du génome. Les mutations se font par : Répétitions = (à très haute fréquence) Substitution de nucléotides Le gène FbsA chez Streptococcus agalactiae 1 2 3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 signal peptide LPKTG 6313 O176 H4A 706 S2 SS1169 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 O90R 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Repetition Souches Exemple de répétitions Région constante Région constante Région hypervariable Evolution par transfert de gènes Conjugaison Transduction Transformation 8 Evolution des génomes Les mécanismes des mutations génétiques 9 Conséquences Mutation silencieuse Mutation neutre Perte de fonction Gain de fonction Site actif non affecté Ala Val Codon stop =>protéine tronquée Mutation d’un AA catalytique Ex : Ex : Structure 3D modifiée Ex : Changement de substrat pour un transporteur Ressemblance ne signifie pas forcément fonction identique Evolution par transfert des gènes Impact négatif : Gènes de résistance aux antibiotiques Gènes de virulence Production d’exopolysaccharides => agent texturant Impact positif : Gènes du métabolisme => acidification, arômes Gènes de biopréservation => bactériocines 10 Importance de la taxonomie 11 Taxonomie = classification des organismes dans un système de taxons permettant de révéler les relations phylogénétiques entre organismes. Grâce aux techniques taxonomiques , il est possible de : -Détecter et identifier les bactéries pathogènes. -Inférer (déduire) les propriétés d’intérêt. ex : une souche de L. lactis => levain d’acidification -Différencier des ferments (souches) entre eux. - Etablir un lien entre une souche et une propriété industrielle. Sous-espèce Souche Lactococcus lactis subsp. lactis Lactococcus lactis Lactococcus Streptococcaceae Lactobacillales Bacilli Firmicutes Bacteria Phylum ou Prokaryota Lactococcus lactis subsp. Lactis IL1403 Notion de rangs taxonomiques 12 Quelle méthode utiliser pour identifier une bactérie ? Rang taxonomique élevé (classe, ordre, famille) => méthode adaptée A l’Echelle du genre => Méthode et tests adaptés relativement précis Echelle intra-espèce (souches) (=typage) => méthode adaptée RFLP AFLP PFGE MLST MLVA 13 Conclusion : le niveau de précision de l’identification de la bactérie dépend de la méthode utilisée. A l’Echelle de l’espèce => Méthode adaptée => Séquence de l’ARN 16S Définition de l’espèce Chez les organismes eucaryotes, la définition de l’espèce biologique repose sur la notion de reproduction sexuelle. Elle est définie comme un ensemble d’organismes reconnaissables partageant une même niche écologique et capables de se reproduire sexuellement entre eux en donnant naissance à une progéniture fertile. Cette définition n’est pas applicable aux procaryotes. Les bactéries forment une très grande diversité comparées à des êtres supérieurs. Ceci résulte de deux principales causes : - D’une part la durée de leur évolution est très différente puisque l’apparition des procaryotes pourrait remonter à trois ou quatre milliards d’années tandis que celle de l’homme par exemple ne remonte qu’à 300 mille ans et le temps de génération est très différent (ex. 20 minutes pour Escherichia coli et 25 ans pour l’homme). -D’autre part, dans la nature les modifications génétiques résultent principalement des mutations et moins souvent de l’échange de matériel génétique. Dans ces conditions la définition de l’espèce bactérienne est difficile. La définition de l’espèce diffère selon les critères retenus. Il n’existe donc pas une définition exacte et universelle de l’espèce bactérienne. Plusieurs propositions ont été formulées, notamment les suivantes : ●Genomospecies : définie comme étant un taxon regroupant des individus issus d’un même ancêtre et ayant conservé une structure génétique complètement ou partiellement identique. Deux bactéries appartenant à la même genomospecies. peuvent donc être phénétiquement différents. Aujourd’hui une genomospecies est définie par un taux d'hybridation ADN-ADN (taux de réassociation de leurs brins d’ADN) supérieur à 70% pour des souches d'une population bactérienne donnée (Wayne et al., 1987; Wellington et Ul-Hassan, 2009). ●Taxospecies : définie comme étant un taxon regroupant des individus adaptés à un une niche écologique, partageant la majorité des caractères phénotypiques et phylogénétiquement plus ou moins semblables et différents des individus des autres taxospecies. ●Nomenspecies : définie dans un but pratique (médicale, industriel…) par quelques caractères intéressants que doit posséder tous les individus du taxon. Définition de l’espèce >> Hybridation ADN-ADN total : ≥ 70% >> DTm ≤ 5°C >> Homogénéité phénotypique des souches d’une même espèce >> Utiliser plusieurs souches pour définir une espèce >> Deux souches dont ARN16S présentent ≤ 98,7% => toujours espèces différentes >> Réciproque pas toujours vrai : possibilité d’avoir des espèces différentes même si ARN 16S >98,7% identité 17 Approche taxonomique phénotypique 18 La classification phénétique ou phénotypique utilise un faible nombre de caractères phénotypiques considérés (jugés) comme importants tels que la morphologie, un caractère biochimique, l’habitat, etc., Cela ne reflète en réalité qu’un nombre très réduit d’information. De plus, les caractères considérés comme importants sont subjectifs et peuvent varier d’un auteur à un autre, ce qui est une source d’instabilité. Il faut savoir également que ces caractères peuvent être absents notamment chez les germes mutants et donc fausser d’avantage l’identification. Approche taxonomique numérique 19 Cette méthode consiste à étudier pour chaque souche, plus d’une centaine de caractères et attribuer la même importance à chacun des caractères qui sont codés 1 (en cas de présence du caractère) ou 0 (en cas d’absence). Les donnés sont introduites dans un ordinateur qui calcule les similitudes entre les individus et les regroupe ainsi en catégories de ressemblance. Approche taxonomique phylogénétique 20 Avec le développement des outils moléculaires et les méthodes génétiques, la taxonomie a considérablement évolué. La taxonomie phylogénétique consiste à comparer les individus sur la base des données génotypiques. Elle permet donc d’établir les liens de parenté entre les individus indépendamment de leur caractères phénotypiques. Plusieurs méthodes : >>Détermination du G + C% >>Les hybridations d’acides nucléiques >>Etude des ADN codant pour l’ARN 16S (PCR) voir avec plus de détail plus loin. Principe Métagénome : ensemble des ADN issus des micro-organismes appartenant à un environnement Objectifs : Identifier, caractériser, déterminer la fonction et exploiter les micro-organismes non cultivés 21 Approche taxonomique métagénomique La taxonomie polyphasique 22 Il s’agit d’une classification qui tient compte d’un maximum de données : phénotypiques (morphologiques, physiologiques, chimio- taxonomiques, écologiques) et phylogénétiques. Plan général du chapitre 1- Connaissances fondamentales sur les approches taxonomiques 2- Etude bactériologique de quatre groupes bactériens (entérobactéries, Pseudomonas, Staphylococcus, Streptococcus) 3- Plan général d’identification des bactéries 4- Tests d’orientation 5- Galerie classique (tests biochimiques, physiologiques et sérologiques) 6- Galerie Api ou galerie rapide (API20 E, API20 NE, API Stph, API Strep) 7- Identification phylogénétique (étude moléculaire ) 8- Identification par Maldi-Tof (technique phénotypique moléculaire ultra précise) Entérobactéries -Les bactéries de cette famille portent le nom d’entérobactéries -entéros = tube digestif / bactéries -Les principaux genres de cette famille sont Escherichia, Klebsiella, Enterobacter et Citrobacter, Proteus, Salmonella, Shigella, Morganella, Yersinia. CARACTÈRES BACTERIOLOGIQUES - Gram négatifs, bâtonnets droits ou coccobacilles - Type respiratoire : aéroanaérobie facultatif - Type trophique : chimioorganotrophe hétérotrophe - Mobiles par ciliature péritriche ou immobiles tel que Klebsiella. - Acapsulés sauf Klebsiella -Asporulés -CARACTÈRES BIOCHIMIQUES ET PHYSIOLOGIQUE - Pas exigeants et mésophiles. Exception: Escherichia coli peut croitre à 44°C. - Catalase + sauf exception - Oxydase – sauf exception - Nitrate réducatuctase + sauf exception - Fermentent le glucose avec ou sans production de gaz -Lactose -, sauf les coliformes (voir plus loin) HABITAT ET uploads/Philosophie/ methodes-d-x27-identification-des-microorganismes.pdf