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Mycobactéries et Mycobacterium tuberculosis Pr BOUKHALFA.S Maitre de conférence

Mycobactéries et Mycobacterium tuberculosis Pr BOUKHALFA.S Maitre de conférences en Bactériologie. Faculté de Médecine, Batna. Généralités M.tuberculosis appartient à la famille des Mycobacteriaceae qui ne renferme qu’un seul genre: le genre mycobacterium subdivisé actuellement en plus de 90 espèces. Parmi les nombreuses espèces de mycobactéries, trois sont responsables de la tuberculose humaine: M.tuberculosis, M.bovis, et M.africanum. Le bacille de koch (ou M.tuberculosis) a été découvert en 1882. En 1921, calmette et Guérin obtiennent un vaccin, le BCG après 13 ans de subculture d’une souche pathogène de M.bovis sur pomme de terre glycérinée. Classification, habitat et pouvoir pathogène Le genre Mycobacterium est le seul genre de la famille des Mycobacteriaceae dans l’ordre des actinomycetales. Actuellement plus de 90 espèces de mycobactéries sont décrites. Les infections dues à des mycobactéries sont divisées en trois grandes entités: La lèpre (M.leprae), la tubercuose (M.tuberculosis, M.bovis, M. africanum), et les mycobactérioses provoquées par les mycobactéries commensales dites « atypiques »: M.avium, M. kansasii, M.marinum…… En fonction de leur vitesse de croissance, les mycobactéries sont séparées en: Mycobactéries à croissance lente, regroupe les espèces:  Pathogènes obligatoires (M.tuberculosis, M.leprae). Potentiellement pathogènes (M.avium, M.marinum, M.xenopi….) Pathogènes opportunistes chez des malades immunodéprimés. Leurs isolement doit conduire le biologiste à confronter ces données aux éléments cliniques et radiologiques. Mycobactéries à croissance rapide: généralement non pathogènes exceptées: M.fortuitum, M.chelonae. Le réservoir de M.tuberculosis et de M.leprae est représenté par l’homme. Les mycobactéries non tubercueuses sont isolées de l’environnement. Pouvoir pathogène de M.tubercuosis: 1. Chez l’homme: La primo-infection tubercueuse est généraement asymptomatique et définie par la seule installation de l’allergie tuberculinique. L’évolution peut se faire vers la guérison comme elle peut donner la tuberculose maladie. La tuberculose pulmonaire cavitaire: plus dangereuse. La tuberculose d’autres organes: ganglionnaire, rénale, génitale, osseuse, péricardique, péritonéale, et méningite tuberculeuse. La miliaire tuberculeuse: dissémination massive du bacille dans tout l’organisme. 2. Chez l’animal: Le cobaye est sensible à MBT, la mort survient après 1 à 3 mois après l’inoculation. Physiopathologie M.tuberculosis Au moment de la primo-infection tuberculeuse, quelques bacilles pénètrent dans l’alvéole pulmonaire par voie aérienne. Les bacilles sont alors phagocytés par les macrophages. L’infection va alors évoluer soit vers la maladie, soit elle va rester latente. Les mécanismes de défense de l’hôte entrent en jeu et le follicule tuberculeux commence à se former. Par la suite, la caséification se produit: processus fondamentale de la tuberculose; nécrose solide des tissus. Une fois le caséum solide se ramollit, l’infection tuberculeuse se transforme en maladie tuberculeuse. La dissémination hématogène est responsable de formes extra- pulmonaires. Caractères bactériologiques 1. Caractères morphologiques: MBT est un bacille immobile à extrémités arrondies de 2 à 5 µm de long sur 0,2 à 0,3 µm de large. non sporulé, non capsulé. Se colore par la coloration de Ziehl-Neelsen et apparait en rose (rouge) sur fond bleu en microscope optique, ce sont des bacilles acido-alcoolo-résistants (BAAR). Paroi des Mycobactéries: Les lipides représente 60% de la constitution de la paroi des Mycobactéries. La structure de base: peptidoglycane lié de façon covalente avec un mycolate d’arabinogalactane. Les acides mycoliques sont des acides gras, ce sont le support de l’acido-alcoolo-résistance des mycobactéries. Il existe également: Des cires: A, B, C, D. Le Cord Factor: formation de cordes en milieu liquide. Les mycosides: A, B, C. Structure de la paroi des Mycobactéries 2. Caractères culturaux:  MBT est caractérisé par ses exigences de culture et par sa lenteur de croissance (3 à 4 semaines). Le temps de génération: 20 heures. Strictement aérobie. T° optimale de croissance: 35 à 37°C. PH optimum: 6,8 à 7. Le MBT ne pousse pas sur les milieux ordinaires, seuls les milieux qui contiennent du sérum, glycérine, de l’œuf, de l’albumine bovine, pomme de terre glycérinée peuvent être utilisés. Les milieux de culture se divise en: 1. Milieux solides à l’œuf coagulé: milieu de Loweintein- jensen qui contient les sels minéraux, asparagine, glycérine, l’œuf et le vert malachite. 2. Milieux solides gélosés: 7H10 et 7H11, ce sont des milieux transparents incubés sous 5 à 10% de CO2. 3. Milieux liquides: Employé dans la production de BCG, et de la préparation de la tuberculine. Milieux de culture Milieu de Lowenstein jensen Milieux liquides (Middelbrook) Sensibilité aux agents physiques et chimiques MBT est très sensible à: chaleur, lumière solaire, rayons X, ultra-violets, l’eau de javel, l’alcool (5 mn par l’alcool à 70°). Il résiste: Au froid, plusieurs années à moins 70°C, à la dessication. Epidémiologie La tuberculose est une maladie contagieuse et la contamination interhumaine s’effectue par voie aérienne. MBT est un parasite stricte de l’espèce humaine. Environ un tiers de la population mondiale est infecté par MBT. Les régions du monde les plus touchées: L’Afrique+++, le pacifique occidental et l’Amérique latine. Le risque annuel élevé d’infection tuberculeuse a été majoré par l’épidémie du Sida. Depuis les années 1990, plusieurs flambés de TBC à bacilles multi-résistants dans le monde ont été signalées, toutes provoquées par une utilisation inadaptée des médicaments anti- tuberculeux. Diagnostic au laboratoire Diagnostic au laboratoire M.tuberculosis La mise en évidence du bacille tuberculeux en microscopie et/ou en culture reste le critère essentiel du diagnostic de certitude de la tuberculose pulmonaire ou extra-pulmonaire. 1. Prélèvements: Les prélèvements doivent être réalisés avant toute antibiothérapie active sur le bacille tuberculeux. 3 à 6 prélèvements sont exigés. a) Les prélèvements pulmonaires: Expectorations (crachats): 3 échantillons. matinal, après un effort de toux. Tubage gastrique: sujets ne sachant pas cracher (enfants, femme); 3 tubages gastriques. Aspiration ou lavage bronchique. Ecouvillonnage laryngé. b)Prélèvements d’origine extra-pulmonaire: Contaminés: urines, pus d’abcès ou de ganglion fistulisé, prélèvement cutané. Non contaminés: LCR, liquide pleural, articulaire, péritonéal, péricardique, ganglionnaire. 2. Fiche de renseignements: Complète + nature et durée du TRT anti-tuberculeux reçu. 3. Conservation et transport: Conservation au froid à +4°C (au max 5 jours). Le transport dans des crachoirs opaques hermétiquement fermés et soigneusement étiquetés. Le transport ne doit pas excéder 3 heures. 4. Examen microscopique: Après confection du frottis , on colore la lame par les colorations usuelles. Fiche technique Coloration de Ziehl neelsen 1er Temps: Coloration - Mettre la lame sur un support en métal ou en verre. - Recouvrir en totalité de fushine de Ziehl filtré sur papier, chauffer doucement jusqu’à émission de vapeur au moyen de la flamme d’un coton trempé dans l’alcool et flamber. - Laisser agir 10 mn, tout en chauffant la lame toute les 03 mn. - Eviter l’ébulition et dessèchement du colorant, si nécessaire ajouter de la fushine pour que la lame soit toujours recouverte. Fiche technique Coloration de Ziehl neelsen 2ème Temps: Décoloration - Il faut rejeter le colorant, laver immédiatement à l’eau ordinaire. - Recouvrir d’acide sulfurique (diluer au ¼) pendant 03mn, laver, recouvrir d’alcool à 90° pendant 05mn et laver. 3ème Temps: Contre coloration recolorer pendant 30 sec par du bleu de méthylène, laver, laisser sécher avant examen microscopique. La lecture se fait au microscope ordinaire avec un objectif à émersion (x100), en créneau. Etapes coloration de Ziehl neelsen Confection du frottis Fixation Coloration par la Fushine Chauffage Décolorer par l’acide sulfurique et l’alcool Etapes coloration de Ziehl neelsen Rincer contre colorer par le bleu de méthylène Rincer Lecture en créneau 300 champs La coloration de Ziehl neelsen est la méthode de référence, elle est spécifique et nécessite 5 à 20 mn par lame. Le MBT apparait en rose (rouge) sur fond bleu. La coloration à l’auramine nécessite 2 à 5 mn par lame donc applicable dans les grands laboratoires recevant un nombre important de prélèvements. Le bacille apparait en teinte vert-jaune en microscope à fluorescence. ses avantages: lecture rapide. ses inconvénients: faux positifs. Les résultats sont exprimés de façon quantitatives. Coloration de Ziehl neelsen Coloration à l’Auramine 5. La culture: permet de porter un diagnostic de certitude de la tuberculose. Le milieu de culture utilisé dans notre laboratoire est le Lowenstein jensen (LJ). L’incubation des tubes ensemensés se fait à 37°C. En pratique, la lecture se fait au: 28èJ, 42 et au 72è jour d’incubation. La culture est positive lorsqu’on note la présence de colonies caractéristiques de MBT sur LJ: Aspect des colonies en choufleur, rugueuses, de teinte crème beige dites eugoniques. Les résultats sont exprimés de façon quantitative. Culture positive sur L.J: colonies de MBT 6. Caractères biochimiques: a) Production de l’acide nicotinique: MBT libère de l’acide nicotinique dans le milieu de culture sans l’utiliser, cette propriété permet d’utiliser un test principal d’identification: Niacine test ou test de Kono. Seul MBT est niacine test (+). b) Réduction des nitrates en nitrites: MBT est NR (+). c) Catalase: Toutes les mycobactéries possèdent une catalase. La catalase est positive à 20°C et négative à 68°C pour MBT catalase thermolabile. Elle est thermostable pour les mycobactéries atypiques. d) Autre caractères: MBT est résistant à l’hydrazide de l’acide thiophène-2- carboxylique ou TCH. Possède une uréase, nicotinamidase, pyrazinamidase. Diagnostic différentiel Caractère M.atypiques M.tuberculosis M.bovis BCG Catalase 20°C + 68°C + + - + - + - Nitrate réductase +/- + - - Niacine test - + - - PNB + - - - TCH + + - - 7. Les nouvelles techniques: Méthodes radiométriques ou bactec. PCR. uploads/Sante/ 17-mycobacterium-tuberculosis.pdf