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doi:10.1684/abc.2014.0940 178 Pour citer cet article : Moalic-Allain V. Pièges

doi:10.1684/abc.2014.0940 178 Pour citer cet article : Moalic-Allain V. Pièges de l’interprétation des anticorps anti-HLA par technologie LuminexTM. Ann Biol Clin 2014 ; 72(2) : 178-84 doi:10.1684/abc.2014.0940 Synthèse Ann Biol Clin 2014 ; 72 (2) : 178-84 Pièges de l’interprétation des anticorps anti-HLA par technologie LuminexTM Pitfalls in interpreting anti-HLA antibodies by LuminexTM technology Virginie Moalic-Allain Laboratoire de génétique moléculaire et d’histocompatibilité, Pôle de pathologie biologie, CHRU Morvan, Brest <virginie.moalic@chu-brest.fr> Article rec ¸u le 04 novembre 2013, accept´ e le 03 février 2014 Résumé. La technologie LuminexTM est devenue incontournable pour la détec- tion et l’identiﬁcation des anticorps anti-HLA. Il s’agit de la technique la plus sensible pour détecter les anticorps anti-HLA chez les patients transplantés et chez les patients en attente d’un greffon. Elle a modiﬁé la stratégie utilisée pour appréhender la compatibilité tissulaire entre donneur et receveur. Cependant, la pertinence clinique des anticorps détectés n’est pas complètement connue, car cette technique est soumise à de nombreux artefacts ou interférences, qui compliquent l’interprétation des résultats pour les biologistes et les cliniciens. L’objectif de cet article est d’expliquer cette technique tout en se concen- trant sur les questions émergentes concernant les performances techniques et l’interprétation des résultats. Nous devons bien garder à l’esprit que les résultats rendus peuvent modiﬁer la prise en charge des patients immunisés, leur aptitude à recevoir un greffon et leur suivi post-greffe. Mots clés : anticorps anti-HLA, LuminexTM, greffe, artefacts, résultats faux positifs Abstract. The LuminexTM technology has become an important tool for HLA antibody screening and identiﬁcation. This is the most sensitive technology to detect HLA antibodies for transplant patients and patients on awaiting list, and it has ushered a new strategy to determine HLA compatibility between donor and recipient. Moreover, the clinical relevance of all detected anti-HLA antibodies is not well understood, because this technique was shown to be prone to many artefacts or interferences, leading to a complicated interpretation for biologists and clinicians. Our objective in this article is to provide a careful consideration about this solid phase assay, and to focus attention on raised questions about technical performance and interpretation of the results. We should keep in mind that our results could change the clinical management of sensitized patients, their aptitude to receive a graft, and their follow-up. Key words: anti-HLA antidody, LuminexTM, artefact, graft, false positive results L’apparition des techniques de détection des anticorps anti- HLA en phase solide telles que la technologie LuminexTM a révolutionné le suivi des candidats à diverses transplan- tations et le suivi des patients greffés. La technologie LuminexTM a augmenté la sensibilité de détection des anticorps anti-HLA, aussi certains ont peut-être eu ten- dance à considérer la technique historique de détection des anticorps anti-HLA dénommée microlymphocyto- toxicité complément dépendante (LCT) comme obsolète. Cependant, certaines interrogations demeurent quant à l’utilisation de la technique LuminexTM à bon escient. En effet, quelle est la pertinence clinique de tous les anti- corps détectés par cette technique ? Sont-ils tous délétères pour le greffon ? La technique en elle-même est soumise Tirés à part : V. Moalic-Allain Ann Biol Clin, vol. 72, n◦2, mars-avril 2014 179 Anticorps anti-HLA par technologie LuminexTM à de nombreuses interférences externes (traitement du patient) ou aléas propres au protocole d’utilisation. Deux problèmes majeurs restent l’absence de standardisation de protocole d’utilisation et l’absence de consensus concer- nant l’interprétation des tests entre fournisseurs et entre laboratoires. Cet article se propose de faire le point sur la détectiondesanticorpspartechnologieLuminexTM,notam- ment sur les difﬁcultés rencontrées au quotidien par les laboratoires lors de l’utilisation et de l’interprétation des tests faits en routine. Principe de la technique LuminexTM La technologie LuminexTM existe désormais depuis plu- sieurs années et est couramment utilisée pour la recherche et l’identiﬁcation des anticorps anti-HLA. Les anticorps anti-HLA préformés avant greffe sont associés à un rejet humoral hyper aigu ou aigu, les anticorps anti-HLA appa- raissant de novo post-greffe sont associés à un rejet humoral aigu ou chronique, et jouent un rôle dans la néphropathie chronique d’allogreffe. Parmi ces anticorps, il existe des anticorps directement dirigés contre un anti- gène du greffon, il s’agit de DSA (donor speciﬁc antibody) [1]. La technologie LuminexTM consiste en une technique de multiplexage de billes de polystyrène, alliant une technique decytométrieenﬂuxàdeuxlasers.Lesbillesutiliséesincor- porent deux ﬂuorochromes, qui, lorsqu’ils sont excités par le premier laser, réémettent des longueurs d’onde dans le rouge (675 nm) et l’infra-rouge (supérieur à 712 nm), créant ainsi un signal permettant d’identiﬁer la bille. En faisant varier la proportion des deux ﬂuorochromes dans chacune des billes, on peut obtenir au moins un jeu de 100 billes différentes. Les billes ainsi créées sont ensuite recouvertes d’antigènes HLA d’une ou plusieurs spéciﬁcités données. La ﬁxation de l’anticorps du patient sur l’antigène de la bille sera révélée par l’utilisation d’un conjugué à base d’anti immunoglobuline humaine marquée à la phycoérythrine. Ce dernier ﬂuorochrome lorsqu’il est excité par le second laser, donne un signal de réémission de longueur d’onde à 575 nm, permettant ainsi d’identiﬁer une réaction posi- tive à la surface de la bille. Ce second signal donne une idée de la quantité d’anticorps ﬁxé par la mesure de la ﬂuo- rescence exprimée en intensité moyenne de ﬂuorescence (MFI) [2]. Plusieurs kits commerciaux sont disponibles, deux sociétés les fabriquent (sociétés One Lambda® et Immucor Trans- plant & Molecular Diagnostics®) : – le screening d’anticorps anti-HLA utilise des kits dont les billes sont recouvertes avec un pool d’antigènes HLA puriﬁés de classe I et de classe II, issus de multiples indivi- dus ; – l’identiﬁcation d’anticorps anti HLA utilise des kits dont les billes sont recouvertes avec des antigènes HLA puriﬁés de classe I ou de classe II, issus d’un seul individu ; – la technique dite de « single antigen » ou SA utilise des kits dont les billes sont recouvertes avec un antigène HLA recombinant correspondant à une seule spéciﬁcité HLA de classe I (HLA-A, HLA-B ou HLA-C) ou à une ou deux spéciﬁcités HLA de classe II (HLA-DRB1, HLA- DQB1/DQA1 ou HLA-DPB1/DPA1). Avantages et intérêt de la technique LuminexTM en greffe d’organes Les avantages de la technique LuminexTM sont nom- breux. Elle est plus sensible pour la détection des anticorps anti-HLA que les autres techniques utilisées, telles que la lymphocytotoxicité complément dépendante (LCT), la technique Elisa ou la cytométrie en ﬂux [3]. Elle per- met de mieux analyser les sérums des patients fortement immunisés et d’identiﬁer plus précisément des spéciﬁcités d’anticorps. Ainsi, elle permet de déterminer des spéciﬁci- tés non trouvées par LCT, telles les anticorps anti HLA-C, anti HLA-DQA1 et anti-HLA DP. De plus, elle permet aussi de déterminer que les anticorps sont plus spéciﬁques d’épitopes que d’antigènes HLA, chaque anticorps étant capable de se lier à plusieurs épitopes, déﬁnis par quelques acides aminés communs à plusieurs antigènes HLA [4-6]. On peut également déﬁnir des anticorps spéciﬁques d’allèles, qui seront formés chez des patients appartenant au même groupe HLA, par exemple détecter un anti- corps anti-HLA-A*24:02 chez un receveur HLA-A*24:03 [3]. Cette technique est utile en pré greffe et en post greffe. Chez les patients immunisés, en attente de greffe, elle permet de déﬁnir des anticorps anti-HLA, et de connaître ainsi le panel de spéciﬁcités antigéniques HLA qui seront acceptées (anti- corps négatif) ou non (anticorps positif) par le receveur. On peut ainsi établir un risque de rejet humoral aigu du gref- fon en fonction du niveau de ﬂuorescence des DSA obtenu par LuminexTM, le rejet aigu humoral impactant fortement la survie du greffon [7-9]. Ceci peut donc permettre de guider le clinicien pour l’acceptation d’un greffon chez les patients immunisés en se basant sur le cross-match virtuel, c’est-à-dire en confrontant le typage HLA du donneur avec le répertoire de spéciﬁcités antigéniques HLA acceptées par le receveur [10, 11]. Un autre intérêt de cette technique est son utilisation pour le suivi de l’efﬁcacité des protocoles de désensibilisation, réalisés chez des patients très fortement immunisés contre le système HLA, inscrits depuis de nombreuses années sur liste d’attente et ayant peu ou pas de proposition de gref- fon. Le traitement des patients par échanges plasmatiques, 180 Ann Biol Clin, vol. 72, n◦2, mars-avril 2014 Synthèse immunoglobulines IV et dans certains cas par d’autres agents tels les anti-CD20 peuvent diminuer le taux et la force des anticorps anti-HLA, le but étant d’obtenir un cross-match de greffe négatif en lymphocytotoxicité, cross- match qui est l’analyse ultime réalisée pour décider de la faisabilité de la greffe [12]. Le niveau de ﬂuorescence des anticorps exprimé par la MFI permet de suivre l’efﬁcacité du traitement lorsque celle-ci décroît [13, 14]. En post- greffe, la présence d’un DSA n’était pas souvent détectée par LCT avant transplantectomie ou rejet avéré. Cela était dû à l’absorption massive du DSA sur le greffon, ce qui conduisait à avoir un taux circulant faible de l’anticorps. Avec la technique LuminexTM, le DSA peut être détecté même si le taux circulant d’anticorps est bas [15]. De nom- breuses études ont montré que la présence d’un DSA en post-greffe peut être associée ou non avec une diminution de la survie du greffon, et la survenue d’épisodes de uploads/Sante/ abc-301342-26277-pieges-de-linterpretation-des-anticorps-anti-hla-par-technologie-luminex-g.pdf