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Ministère de l’enseignement supérieur et de la Recherche Scientifique Départeme

Ministère de l’enseignement supérieur et de la Recherche Scientifique Département BCP Mémoire de Projet de Fin d’Etudes Présenté pour l’obtention du Diplôme National d’Ingénieur en Génie biologique Et réalisé par Sahmim khaoula Sujet : Les polymorphismes génotypiques de récepteur de la chimiokine FKN: le CX3XCR1 chez des patients atteints d’hépatite B chronique Soutenu le …..devant le jury d’examen composé de : Année universitaire 2020-2021 Dr. Imen Ben Dhifallah Dr. Manel BEN MANSOUR Docteur (Chef de Département BCP) Encadrant Académique Invitée Résumé Nous avons réalisé l’étude des deux polymorphismes V249I et T280M dans la séquence codante du récepteur CX3CR1 de la FKN avec la susceptibilité à l’infection par le virus de l’hépatite B (HBV) et avec les facteurs liés au sexe, à l’âge et à la charge virale du patient. Les échantillons d’ADN génomique sont extraits à partir du sang total des patients par la technique de salting-out puis amplifiés par PCR. Les amplifias sont digérés par des enzymes de restriction puis visualisés sur gel de migration pour révéler les profils de digestion enzymatique de la PCR-RFLP. Une étude statistique permet de rechercher une association de ces deux polymorphismes avec l’infection par le virus de l’hépatite B. Mots clés : Hépatite B, virus de l’hépatite B, FKN, CX3CR1, Polymorphisme, SNP, V249I, T280M, PCR-RFLP, Association génétique, Etude statistique. Abstract We performed the study of the two polymorphisms V249I and T280M in the coding sequence of the fractalkine receptor ; CX3CR1 with susceptibility to hepatitis B virus (HBV) infection and with factors related to the patient's gender, age and viral load. Genomic DNA samples are extracted from patients whole blood by the salting-out technique and amplified by PCR. The amplified sequences are digested with restriction enzymes and visualized on a migration gel to reveal the PCR-RFLP enzymatic digestion profiles. A statistical study allows to search for an association of these two polymorphisms with the hepatitis B virus infection. Keywords : Hepatitis B, hepatitis B virus, FKN, CX3CR1, Polymorphism, SNP, V249I, T280M, PCR-RFLP, Genetic association, Statistical study. Dédicace Je tiens à dédier ce travail avec un grand plaisir A mes chers parents Ma mère et mon père, aucune dédicace ne saurait suffisante pour exprimer mon amour et mon respect. Ils ont tout fait pour mon bonheur et ma réussite depuis mon enfance, je suis ici grâce à eux et ses sacrifices j’aimerais profiter de ces quelques lignes pour les exprimer mon éternel amour. A ma jumelle Ma jumelle de corps et d’âme, la plus belle version de moi. Tu étais toujours là pour me soutenir et m’encourager, tout simplement tu es toutes les choses belles de ma vie. Merci pour ton soutien et support de mes sauts d’humeurs. A mes sœurs ; A mon frère Aucun langage ne saurait exprimer mon respect et ma considération pour votre soutien. Cher benjamin et chère benjamine, je vous dédie ce travail en reconnaissance de l’amour que vous m’offrez quotidiennement. A mon cher fiancé J’ai tant de choses à te dire que je n’en dirai qu’une : merci d’être là A mes chers amis En témoignage de l’amitié qui nous unit et des souvenirs de tous les moments que nous avons passés ensemble, je vous dédie ce travail. A mes collègues Pour votre gentillesse et votre collaboration, puisse Dieu vous garder, éclairer votre route et vous aider à réaliser à votre tour vos vœux les plus chers. A l’âme de mon grand-père et mon oncle Vous êtes toujours présents ; cher oncle je suis en train de devenir votre lazher Arrouch. A tous mes chers proches et à tout qui contribué du loin ou du près à ce travail Remerciements Ce travail a été réalisé au sein du laboratoire Virologie Clinique à l’institut pasteur de Tunis. Je tiens à adresser mes premiers remerciements à Pr Henda TRIKI, professeur en microbiologie et responsable du laboratoire de virologie clinique à l’institut pasteur de Tunis de m’avoir accueillie au sein de son laboratoire. Je tiens à exprimer ma plus grande reconnaissance au Dr. Imen BEN DHIFALLAH responsable de l’encadrement de ce projet, pour sa confiance, sa patience et sa disponibilité. La façon dont elle m’a guidé, conseillé et encouragé tout au long de projet m’a permis de progresser et d’aboutir à la production de ce travail, je suis très honorée de vous compter parmi mon jury. J’ai l’immense privilège de vous avoir comme encadreur. Je remercie vivement mademoiselle AYOUNI kaouther, doctorante au sein du laboratoire de virologie clinique pour l’accueil qu’elle m’a réservé, le temps qu’elle m’a accordé, et plus globalement, pour toutes les précieux informations, réflexions, corrections qu’elle m’a apportées et qui ont nourri ce travail. Je remercie les membres du jury d’avoir bien voulu porter intérêt à ce travail et pour m’avoir fait l’honneur de le juger. Veuillez trouver ici l’expression de ma profonde gratitude. Je souhaite adresser mes vifs remerciements à l’ensemble du Personnel du Département de BCP de l’Ecole Centrale Polytechnique de Tunis et tout particulièrement au Docteur BEN MANSOUR Manel, ainsi qu’à tous mes professeurs tout au long du mon parcours académique pour leurs soutiens, leurs disponibilités, leurs rigueurs scientifiques, leurs critiques et pour leurs encouragements continus. Liste des abréviations AA : Acide aminé Ag : Antigène Ag HBe : protéine pré-Core ou protéine e Ag HBs : Antigène de surface de l’hépatite B ADN : Acide désoxyribonucléique ADNccc : ADN circulaire super enroulé ADN RC : ADN relaxé circulaire ARN : Acide ribonucléique ARNm : Acide ribonucléique messager ARNpg : ARN pré-génomique CHC : Carcinome hépatocellulaire CTD : Domaine C Terminal DEPC : Diéthyl pyrocarbonate DO : Densité optique EDTA : Acide éthylène diamine tétra-acétique EPS : Etablissement Public de Santé FKN : Fractalkine HBc : protéine de capside Core HWE : Equilibre de Hardy-Weinberg IC : Intervalle de confiance IPT : Institut Pasteur Tunis KDa : Kilo Dalton L-HBs : La grande protéine de surface de l’hépatite B M- HBs : La moyenne protéine de surface de l’hépatite B NES : Signale d’Export Nucléaire NLS : Signale de Localisation Nucléaire NTD : Domaine N Terminal OMS : Organisation Mondiale de Santé OR : Odds-Ratio ORF : Open Reading Frame : cadre ouvert de lecture Pb : Paire de base PCR : Réaction de polymérisation en chaine PCR-RFLP : Réaction de polymérisation en chaine de polymorphisme de longueur de fragment de restriction POL : Polymérase RE : Réticulum endoplasmique Rnase H : ribonucléase H RR : Risque relatif SLB : Solution de lyse des globules blancs SLR : Solution de lyse des globules rouges SNP : (Single Nucleotide Polymorphism) polymorphisme à nucléotide simple S-HBs : La petite protéine de surface de l’hépatite B UI : Unité internationale VHB : Virus de l’hépatite B VHC : Virus de l’hépatite C X2 : Test de Chi deux µl : microlitres Liste des Figures Figure 1 : Accréditations du laboratoire de virologie clinique.....................................................18 Figure 2 : Micrographe cryo-électronique de virions isolés à partir des patients infectés chroniquement par le VHB (slezer et zlotink, 2015)...................................................................20 Figure 3: Présentation schématique de la structure de la particule de Dane (Tsukuda et Watashi, 2020)..............................................................................................................................22 Figure 4: Structure des particules subvirales. A : particule sphérique / B : particule longitudinale (Nester, 2009)...............................................................................................................................22 Figure 5: Organisation du génome du VHB (Minor et Slagle, 2014).........................................24 Figure 6 : Structure des protéines d’enveloppe (L, M, S) (Urban et al., 2014)..........................25 Figure 7 : Modèle proposé avec une double topologie de L-HBs (liaison à la capside à gauche, liaison au récepteur à droite) (Seitz et al., 2016)..........................................................................26 Figure 8 : Représentation schématique des domaines de la polymérase du VHB (Buhlig et al., 2020)..............................................................................................................................................27 Figure 9 : Le cycle de réplication de HBV (Zoulim, 2006).........................................................28 Figure 10: Histoire naturelle de l’infection par le VHB (Hézode, 2010).....................................31 Figure 11 : Structure du récepteur CX3CR1................................................................................33 Figure 12 : Produits amplifiés sur gel d’agarose à 1% coloré au RedGelTM ...............................47 Figure 13 : Produits digérés sur gel d’agarose à 3% coloré au GelRedTM....................................48 Liste des Tableaux Tableau I : Séquences des amorces utilisés..................................................................................40 Tableau II : Conditions expérimentales de la préparation du mix réactionnel du PCR pour le gène CX3CR1................................................................................................................................40 Tableau III : Protocole de digestion enzymatique.......................................................................42 Tableau IV : Enzymes de restriction utilisées et taille des fragments obtenus après digestion.. .42 Tableau V : Tableau de contingence 2x2.....................................................................................44 Tableau VI : Fréquences alléliques et génotypiques des polymorphismes V249I et T280M chez les patients infectés par le VHB et les témoins.............................................................................50 Tableau VII : Les polymorphismes V249I et T280M du gène CX3CR1 suivant le sexe chez les patients atteints de l’hépatite B......................................................................................................51 Tableau VIII : Les polymorphismes V249I et T280M du gène CX3CR1 suivant l’âge chez les patients atteints de l’hépatite B......................................................................................................52 Tableau IX : Les polymorphismes V249I et T280M du gène CX3CR1 suivant la charge virale chez les patients atteints de l’hépatite B........................................................................................54 Table des matières Chapitre I : Présentation de l’organisme d’accueil........................................................................15 1- Historique...........................................................................................................................16 2- Mission :.............................................................................................................................17 3- Laboratoire de virologie clinique :.....................................................................................17 3.1. Présentation Générale du laboratoire :........................................................................17 3.2. Accréditation...............................................................................................................18 Chapitre II : Etude bibliographique...............................................................................................19 Partie I : Virus de l’hépatite B.............................................................................20 1- Historique...........................................................................................................................20 2- Classification......................................................................................................................21 3- Structure uploads/Geographie/ rapport-fin-d-etude-khaoula-sahmim.pdf