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METHODES D’ANALYSE DE LISTERIA MONOCYTOGENES (résumé de l'intervention de Mme R

METHODES D’ANALYSE DE LISTERIA MONOCYTOGENES (résumé de l'intervention de Mme ROLLIER de CECALAIT lors de l'Assemblée générale de CECALAIT) isteria monocytogenes est une préoccupation constante en hygiène alimentaire en général, et dans le secteur laitier, en particulier, du fait de sa fréquence dans l’environnement et de son extrême résistance à de sévères conditions physico- chimiques. Des critères réglementaires clairement établis depuis 1992 ont conduit à l’accroissement du nombre de contrôles officiels et d’autocontrôles de la production à la distribution. D’où une forte augmentation du nombre de méthodes de recherche disponibles, de leur facilité de mise en œuvre, de leur spécificité et de leur rapidité. La méthode de référence ISO 11290-1/2 a, en outre, été l’objet d’un programme européen de grande ampleur, destiné à établir ses performances de fidélité. epuis le début de l’année 1999, une succession d’alertes à Listeria monocytogenes dans les aliments et deux cas mortels de listériose ont focalisé l’attention du public et des professionnels sur ce problème d’hygiène alimentaire. La listériose est une maladie plutôt rare – 225 cas en France en 1997- dont l’origine est essentiellement alimentaire. Se traduisant par des symptômes similaires à ceux d’une grippe et sans conséquence chez la plupart des sujets, elle a en revanche des conséquences graves, méningite ou septicémie très souvent mortelles, chez des sujets à risque : les personnes âgées, les nouveaux-nés, les personnes immunodéprimées à la suite de traitements ou de maladies. Chez les femmes enceintes, elle aboutit le plus souvent à un avortement au cours des 2e et 3e trimestres ou à la mort du nouveau-né. Elle est due au germe Listeria monocytogenes, dont la dose infectante est mal connue et vraisemblablement dépendante de la personne et des conditions de contamination. Or ce germe est, à la fois, très fréquent dans l’environnement et exceptionnellement résistant. En tout état de cause, la réglementation laitière, à savoir la directive CEE 92/46 et l’arrêté du 30/3/ 1994 spécifie son absence dans 25 g (lait, fromages…) ou plus rarement dans 1 g. Cependant en France, la note de service de la DGAL du 13/7/1994 autorise une dérogation pour les produits à base de lait présentant des caractéristiques traditionnelles en y tolérant 100 germes / g à la DLC / DLUO. La détection de L. monocytogenes dans les aliments est donc un enjeu majeur en hygiène alimentaire. D’où une demande forte pour d’une part, l’amélioration de la rapidité, de la facilité et de la spécificité des méthodes ; d’autre part, la détermination des performances analytiques des méthodes de référence. Un germe résistant et ubiquiste Listeria monocytogenes est un bacille Gram +, mobile à 22°C et non à 37°C, aéro-anaérobie, c’est à dire préférant les tensions réduites en oxygène – par exemple celles observées dans les conditionnements sous vide ou sous atmosphère modifiée -. C’est un germe remarquablement résistant aux agents chimiques, ainsi qu’à des conditions sévères de température, pH ou salinité, comme le montre le tableau 1 ci-contre. température pH NaCl optimum de croissance optimal growth 30 – 37°C 7,2 – 7,6 0,5 – 5% croissance possible possible growth 1 – 45°C 4,7 – 9,6 maxi 12% survie possible possible survival 30 mn, 55°C 4,2 (> 24h, 37°C) maxi 30% (5 jours à 37°C) (5 days at 37°C) tableau 1 : croissance et résistance de Listeria monocytogenes (table 1 : growth and resistance of Listeria monocytogenes) Dès lors, on le rencontre dans tous les milieux : l’air, le sol, l’eau, les poussières, les sédiments, les végétaux, les aliments, les porteurs sains…En ce qui concerne les aliments, la DGCCRF conduit, tous les ans, des plans de surveillance de leur taux et de leur fréquence de contamination. Les plans de 1993 à 1995 montrent ainsi que celle-ci, relativement importante pour les produits carnés (avec environ 15% d’échantillons positifs) va ensuite en décroissant pour les produits de la mer, les produits végétaux, les pâtisseries et les produits laitiers. Cependant, la contamination des produits laitiers est souvent spécifique aux fromages à pâte molle et présente alors des taux généralement plus élevés que les autres aliments. L’observation des principales épidémies d’origine alimentaire recensées depuis le début des années 80, montre de même, une grande diversité des aliments responsables, depuis les choux jusqu’à la charcuterie (rillettes, hot dog….), en passant par les produits laitiers (fromages à pâte molle, lait pasteurisé…) et sans oublier les produits de la mer ! Elle souligne, en revanche, une large prédominance du sérotype 4b, en tant qu’agent responsable. Enfin, elle dessine une tendance récente à la diminution de la durée et du nombre de cas des épidémies. Ce résultat positif est sans aucun doute à mettre au crédit de l’amélioration du réseau épidémiologique, avec notamment des contrôles officiels et des L D autocontrôles plus fréquents à tous les stades, de la fabrication à la distribution et de l’amélioration des méthodes d’analyse. Une nécessaire évolution des méthodes Cette augmentation du nombre des contrôles, à relier au respect des critères fixés par la réglementation, exigeait une amélioration des méthodes disponibles pour la recherche de Listeria monocytogenes. En effet, les méthodes classiques, antérieures à 1988, sont de mise en oeuvre particulièrement longue et délicate. Le tableau 2, ci-dessous retrace brièvement l’évolution des méthodes tableau 2 : évolution des méthodes de recherche et de dénombrement de Listeria monocytogenes table 2 : evolution of the methods of detection and enumeration of Listeria monocytogenes Etapes importantes important steps Enrichissement enrichment Géloses d’isolement sélectif agar for selective isolation Identification Numération enumeration Méthodes classiques classical methods 1985 – 88 LEB LEB modifié MMA + transillumination oblique + Henry illumination + identification Galerie Classique classic test strip + hémolyse + hemolysis ou Camp test NPP : LEB MPN : LEB + MMA + Identification Amélioration des méthodes improvement of the methods 1988 Fraser ½ + Fraser (1993) PALCAM (1988) OXFORD (1989) +identification Mini galeries micro strips (API Listeria) (1990) Gélose PALCAM agar + Identification Méthodes rapides rapid methods Listeria spp 1988 milieu d’enrichissement propre à la méthode Immuno (1988) immunoassays (1988) Sondes ADN DNA probes (1989) Méthodes rapides rapid methods L. monocyt. 1992 enrichment medium corresponding to each method ALOA (1998) Rapid L mono (1998) Immuno (1995) immunoassays (1995) Sondes ADN, PCR DNA probes, PCR (1992) ALOA Rapid L mono LEB : Listeria enrichment broth MMA : modified Mac Bride Agar NPP : nombre le plus probable = MPN : most probable number Les méthodes de référence, c’est à dire, aujourd’hui, NF EN ISO 11290-1 et 2 de février 1997 et août 1998 (V 08-028-1 et –2), d’une part et FIL 143A:1995, d’autre part, ont profité de l’amélioration des milieux d’enrichissement et des géloses, signalée dans le tableau 2. Les performances analytiques de la méthode ISO viennent, en outre, d’être validées dans le cadre d’un vaste programme européen (cf ci-dessous). Leur durée de réalisation reste cependant trop longue pour les besoins routiniers des laboratoires. D’où la floraison de méthodes rapides, pour le genre Listeria d’abord, puis pour l’espèce L. monocytogenes. Elles sont pour la plupart validées par l’AFNOR et ont permis une réduction très nette de la durée des analyses, comme le montre le tableau 3 ci-dessous. Cependant, l’étape d’enrichissement restant nécessaire, il est difficile, pour le moment, de descendre sous 48 heures. Tableau 3 : principales méthodes rapides de détection des Listeria table 3 : major rapid methods for the detection of Listeria Principe Méthode Détection (detection) Durée (h) (duration) principle method Listeria L. mono 24 48 72 Sonde Gene Trak nucléique Gen Probe DNA Probelia probe Transia Immuno Tecra -enzym. Vidas Eia Foss Immuno- magnét. Lister- screen Immuno- chromato Listeria Rapid Test (en partie d’après Revue Laitière Française n° 547, février 1995) CECALAIT organisant des essais interlaboratoires d’aptitude pour la détection de Listeria dans le lait depuis 1993, a pu observer les changements dans les pratiques des laboratoires. Ceux-ci ont clairement suivi l’évolution et la diversification des méthodes proposées. En témoigne l’ensemble des graphiques présentés dans la figure 1, à la fin de cet article. Elle compare les milieux d’enrichissement, les milieux d’isolement et les techniques d’identification utilisés entre le premier essai interlaboratoire en mars 1993 et le dernier essai en date (avril 1999). Il faut noter cependant que les utilisateurs de méthodes rapides continuent à utiliser souvent les méthodes classiques pour confirmation. C’est dire l’intérêt que vont présenter les conclusions du programme européen de validation des méthodes ISO 11290-1 & 2 de détection et de dénombrement de Listeria monocytogenes. Le programme européen sur les méthodes microbiologiques. Il s’agit d’un programme de validation, par essais inter-laboratoires, de six méthodes microbiologiques ISO, destiné à y introduire des paramètres de fidélité, qui seront repris dans les normes européennes et internationales par le CEN et l’ISO. Les méthodes concernées portent sur la détection et/ou le dénombrement des microorganismes pathogènes suivants : Listeria monocytogenes , Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens , Bacillus cereus, Salmonella. Après l’étude concernant Bacillus cereus, dont nous avions rendu compte, en son temps, (cf La Lettre de CECALAIT, n°26), ce sont les validations des méthodes de détection et dénombrement de Listeria monocytogenes qui ont été menées à bien. ª ETUDES COLLABORATIVES uploads/Industriel/ lettre-42-1523020489.pdf