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Université de Montréal Études cinétiques par HPLC et purification de la y-gluta

Université de Montréal Études cinétiques par HPLC et purification de la y-glutamyltranspeptidase recombinante humaine provenant des levures par Mylène Morin Département de chimie Faculté des arts et des sciences Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures en vue de l’obtention du grade de Maître ès sciences (M.Sc.) en chimie Janvier 2007 © Mylène Morin, 2007 C Université de Montréal Direction des bibliothèques AVIS L’auteur a autorisé l’Université de Montréal à reproduire et diffuser, en totalité ou en partie, par quelque moyen que ce soit et sur quelque support que ce soit, et exclusivement à des fins non lucratives d’enseignement et de recherche, des copies de ce mémoire ou de cette thèse. L’auteur et les coauteurs le cas échéant conservent la propriété du droit d’auteur et des droits moraux qui protègent ce document. Ni la thèse ou le mémoire, ni des extraits substantiels de ce document, ne doivent être imprimés ou autrement reproduits sans l’autorisation de l’auteur. Afin de se conformer à la Loi canadienne sur la protection des renseignements personnels, quelques formulaires secondaires, coordonnées ou signatures intégrées au texte ont pu être enlevés de ce document. Bien que cela ait pu affecter la pagination, il n’y a aucun contenu manquant. NOTICE The author of this thesis or dissertation has granted a nonexclusive license allowing Université de Montréal to reproduce and publish the document, in part or in whole, and in any format, solely for noncommercial educational and research purposes. The author and co-authors if applicable retain copyright ownership and moral rights in this document. Neither the whole thesis or dissertation, nor substantial extracts from it, may be printed or otherwise reproduced without the author’s permission. In compliance with the Canadian Privacy Act some supporting forms, contact information or signatures may have been removed from the document. While this may affect the document page count, it does not represent any loss of content from the document. 11 Université de Montréal Faculté des études supérieures Ce mémoire intitulé Études cinétiques par HPLC et purification de la y-glutamyltranspeptidase recombinante humaine provenant des levures présenté par: Mylène Morin a été évalué par un jury composé des personnes suivantes: Pr. Joelle Pelletier Présidente-rapporteuse Pr. Jeffrey W. Keillor Directeur de recherche Pr. Andreea Schrnitzer Membre du jury 111 RÉSUMÉ La y-glutamyltranspeptidase (GOT. EC 2.3.2.2) est une enzyme hétérodirnérique qui est hautement glycosylée. Cette enzyme est liée à la membrane externe des cellules et se trouve en grande quantité dans les reins, le cerveau et le pancréas. Il semblerait que la GGT soit impliquée dans différents désordres physiologiques comme la maladie de Parkinson. l’inhibition de l’apoptose et le diabète. La GGT peut catalyser autant la réaction d’hydrolyse que la réaction de transpeptidation en transférant un groupement y-glutamyle à un acide aminé ou un dipeptide. La mesure de l’activité hydrolytique et de transpeptidation pour le substrat natif de cette enzyme est un défi, car le glutathion (GSH) est un substrat qui ne possède aucun groupement chrornophore. C’est pour cette raison qu’une méthode HPLC en phase inverse permettant la détection quantitative de plusieurs substrats et produits a été développée. La détection des différentes substances est possible grâce à la dérivation précolonne au chlorure de dabsyle. ce qui permet d’ajouter un groupement chromophore. L’application de cette méthode a permis de déterminer les données cinétiques de la réaction de transpeptidation de la GOY de reins de rat avec le substrat natif, GSH. Cette méthode a aussi été utilisée pour l’analyse de différents substrats analogues au glutathion. La courbe pH-vitesse effectuée, vient confirmer l’ionisation d’au moins deux résidus jouant le rôle d’acide général et de base générale. De plus. une courbe de Bronsted tracée à partir de substrats analogues au GSH a permis d’émettre l’hypothèse que l’interaction entre l’enzyme et le substrat n’est pas en relation avec la basicité du groupe partant durant l’étape d’acylation. Ensuite, l’optimisation de l’expression de la GGT humaine recombinante a été effectuée afin d’obtenir une grande quantité d’enzyme qui permettrait d’étudier en profondeur son mécanisme et son importance au niveau physiologique. La GGT iv humaine recombinante ne contient pas d’ancre transmembranaire, mais est liée à une séquence de six histidines (<d-lis-tag»). Un plasmide encodant cette enzyme a été transformé dans la levure F. pastoris. La GGT est sécrétée dans le milieu de culture et, finalement, à partir de 25 à 30 reins de rats la quantité de GGT obtenue est plus faible que la quantité de GGT humaine recombinante purifiée provenant d’un litre de culture par cette nouvelle méthode. Mots-clés enzyme. y-glutamyltranspeptidase. glutathion. HPLC. chlorure de dabsyle, courbe pH-vitesse, levure, expression, purification. V SUMMARY y-Glutamyltranspeptidase (GUI, EC 2.3.2.2) is a highly glycosylated heterodimeric enzyme. It is bound to the extemal membrane of ceils and is highly abundant in the kidney, brain and pancreas. It is implicated in various physiological disorders such as Parkinson’s disease, inhibition of apoptosis and diabetes. GGI can catalyse hydrolvsis as well as transpeptidation by transferring a 7-gituarnyl group to an amino acid or peptide. Measuring the hydrolytic and transpeptidation activity of this enzyme is challenging, since its native substrate glutathione (GSH) does flot possess a chromophoric group. For this reason, an HPLC-based method was developed to allow the quantitative detection of several substrates and products. Ihe detection of these different compounds is achieved through the pre-colurnn derivatization with dabs lchloride. resulting in the addition ofa chromophore. The application of this method allowed kinetic data to be measured for the transpeptidation reaction of GGI with GSH, its native substrate. The method was also used to analyze several substrate analogues of GSH. A pH-rate profile was deterrnined that confirms the ionisation of at least two residues. furthermore, a Bronsted plot constructed for a series of substrate analogues led to the hypothesis that the interaction between the enzyme and the substrate during the acylation step is not related to the basicity ofthe leaving group. Next. the optimisation ofthe expression of recombinant human GGT was carried out in order to obtain a large quantity of enzyme that would allow its mechanism and physiological importance to be studied in greater depth. The recombinant human GGI constructed does not contain a transmembrane anchor, but is linked to a sequence containg six histidines (“His-tag”). A plasmid encoding this enzyme was transformed into P. pastoris yeast. GGT was secreted into the culture and the amount of GGI isolated from 25-30 rat kidnevs is inferior to that obtained from IL of culture. vi Key-words: enzyme. y-gÏutamyltranspeptidase, gÏutathione. HPLC, dabsyl chloride. pH-rate profile. yeast. expression, purification vii TABLE DES MATIÈRES RÉSUMÉ iii TABLE DES MATIÈRES vii LISTE DES FIGURES i LISTE DES SCHÉMAS xi LISTE DES TABLEAUX xii LISTE DES ABRÉVIATIONS xiii DÉDICACE xvi REMERCIEMENTS xvii CHAPITRE 1: INTRODUCTION I 1.1 DÉCOUVERTE DES ENZYMES 2 1.2 LA y-GLUTAMYLTRANSPEPTIDASE 4 1.2. 1 Gé,7éralités 4 1.2.2 Rôles phi’siologiques 5 1.2.3 Réactions catalysées 8 1.2.4 Substrats de la GGT 10 ].2.5 Sites de liaison et catalytique de la GGT 11 1.2.5.1 Site de liaison 13 1.2.5.2 Site catalytique de la GGT 14 1 .3 OBJECTIFS DE RECHERCHE 16 1.3.1 Optimisation et validation d’une méthode d’analyse par HPLC 17 1.3.2 Synthèse d’un substrat analogue et études cinétiques de / ‘étape d ‘acvlatio,7 17 1.3.3 Optimisation de l’expression et de la purification de la GGTreco,nbinante hwnaine exprimée dans les levures 18 CHAPITRE 2 : OPTIMISATION ET VALIDATION D’UNE MÉTHODE D’ANALYSE PAR HPLC t9 2.1 INTRODUCTION 20 2.2 PRÉSENTATION DE LA MÉTHODE DÉVELOPPÉE EN PARTIE DANS NOTRE GROUPE54 22 2.3 OPTIMISATION DE LA MÉTHODE 26 2.4 ÉTUDES CINÉTIQUES 29 2.1.1 Courbe pH—vitesse du glutathion comme substrat donneu 29 2.1.2 Détermination des constantes cinétiques de L-Ala-Glv lors de la désacylation 32 2.4.2.1 Synthèse du L-y-GIu-L-AIa-GIv 33 2.4.2.2 Courbe étalon et résultats cinétiques 35 2.5 CONCLUSION 37 vil’ CHAPITRE 3 :ÉTUDES CINÉTIQUES DE L’ÉTAPE D’ACYLATION CATALYSÉE PAR LA GGT À PARTIR DE SUBSTRATS SYNTHÉTISÉS ANALOGUES AU GLUTATHION 38 3.1 INTRODUCTION 39 3.2 RÉSULTATS ET DISCUSSION 45 3.2.1 Synthèse de la L-glutainj’Ï-2-’éthylthio,)éthylamide 45 3.2.2 Courbe de Bronsted comprenant le substrat L— y-glutainvl—2—féthylthio)éthvlamide 17 3.3 CONCLUSION 53 CHAPITRE 4 : OPTIMISATION DE L’EXPRESSION ET DE LA PURIFICATION DE LA GGT DANS LES LEVURES PK’HIA PASTORIS 55 4.1 INTRODUCTION 56 4. 1.] Purification de GGT dans différents systè,nes 56 4. 1.2 Méthodes connues pour / ‘expression et la purification de GG T humaine reconibinante 57 4.1.3 Clonage du gène de la GGT hmnaine dans un plasmide et transJàrination des bactéries E. coli 58 4.2 OPTIMISATION DE L’EXPRESSION 62 4.2.1 Linéarisation du plasinide purifié, transjbrniation des levures P.pasioris et vérification de / ‘intégration du gène 62 4.2.2 Expression de la GGT dans P.pastoris 65 1.2.3 Expression à plus grande échelle de la GGT dans P.pastoris 67 4.2.4 Concentration de la GGTliuniaine reconibinante 68 4.2.5 Purification de la GGT humaine recomnbinante 70 4.3 CONCLUSION 76 CHAPITRES : CONCLUSION 78 CHAPITRE 6: PARTiE EXPÉRIMENTALE 82 6.1 SYNTHÉSE DE SUBSTRATS ANALOGUES $3 6.1.1 Matériel 83 6.1.2 Méthode expérimentale 84 6.2 MÉTHODE PAR HPLC EN PHASE INVERSE COUPLÉE À LA DÉRIVATION CHIMIQUE PAR LE CI-ILORURE DE DABSYLE 94 6.2.1 Matériel 94 6.3 EXPRESSION ET PURIFICATION DE LA GGT uploads/Litterature/ morin-mylene-2007-memoire.pdf