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Ann Toxicol Anal. 2010; 22(2): 69-74 c ⃝Société Française de Toxicologie Analyt

Ann Toxicol Anal. 2010; 22(2): 69-74 c ⃝Société Française de Toxicologie Analytique 2010 DOI: 10.1051/ata/2010012 Disponible en ligne www.ata-journal.org Revue générale Préparation d’échantillons pour analyses en immunochimie Sample preparation for immunoassay analysis in toxicology Bertrand Brunet⋆, Yves Papet, Patrick Mura Centre Hospitalier Universitaire, Service de toxicologie et pharmacocinétique, BP 577, 86021 Poitiers Cedex, France Résumé – Introduction : Malgré l’essor des techniques chromatographiques couplées à la spectrométrie de masse, l’immunoanalyse revêt toujours une importance capitale dans les laboratoires hospitaliers et de médecine légale. Nous nous attacherons ici à décrire quels pourraient être les protocoles à mettre en œuvre pour utiliser ces tests immunochi- miques sur des matrices non conventionnelles (sang total laqué, cheveux. . . ) et sur les préparations nécessaires pour analyser ces échantillons. Méthodes : Diﬀérentes techniques immunochimiques avec leur aptitude à accepter des ma- trices dites alternatives seront évoquées. Une application utilisant une défécation du sang total avec de l’acétone est proposée. Quatre paramètres importants en toxicologie (paracétamol, phénobarbital, digoxine et valproate de sodium) ont été testés sur plasma et sur sang total avec cette technique. Les corrélations entre les résultats obtenus sont présen- tées. Un point particulier est fait sur la préparation d’échantillons en vue de l’analyse de matrices alternatives (cheveux, humeur vitrée, salive. . . ) avec des méthodes immunochimiques. Résultats : La procédure présentée ici pour l’analyse du paracétamol, du phénobarbital, de la digoxine et du valproate de sodium dans le sang total par méthode CEDIA donne de bons résultats avec des corrélations satisfaisantes entre les valeurs obtenues sur plasma le jour du prélèvement et les valeurs obtenues sur sang total quelques semaines après. Conclusion : Les avantages des tests immunochimiques sont bien connus ; ils peuvent être automatisables, permettent une grande cadence et un résultat rapide. Leur utilisation en toxicologie médico-légale reste compliquée par la nature des échantillons disponibles. S’ils peuvent être utiles dans un but de screening, une conﬁrmation par méthode chromatographique reste indispensable. Mots clés : Immunoanalyse, matrices alternatives, préparation d’échantillons Abstract – Introduction: Despite the breakthrough of chromatographic techniques coupled to mass spectrometry, immunoanalysis is still a key component of the various techniques used in clinical or forensic toxicology. This article describes diﬀerent procedures to use immunoassays on unconventional biological matrices such as clotted blood or hair specimens. A focus is made on sample preparation needed to analyse such matrices. Methods: Various immunoassay techniques and their ability to accept unconventional matrices are discussed. An application using protein precipita- tion with acetone is proposed for the analysis of four relevant compounds in toxicology: valproic acid, acetaminophen, digoxin and phenobarbital. Correlations between results obtained on plasma and whole blood after several weeks of storage are presented. A focus is made on sample preparation for hair specimens, vitreous humor and saliva before analysis with immunoassay tests. Results: The procedure presented for the analysis of valproic acid, acetaminophen, digoxin and phenobarbital with CEDIA reagents gives satisfactory results in whole blood. Good correlations are ob- tained between whole blood and plasma for the same samples. Conclusion: Advantages of immunoassay testing are well known, it is a high capacity, rapidity and possibility of automation. The use of immunoassays in forensic toxicol- ogy is complicated by the nature and the quality of the samples available. These immunochemical methods can serve as screening techniques but conﬁrmation of positive results is always recommended. Key words: Immunoanalysis, alternative matrices, sample preparation Reçu le 17 février 2010, accepté après modiﬁcations le 2 avril 2010 Publication en ligne le 26 mai 2010 1 Introduction Les techniques chromatographiques en phase liquide ou gazeuse couplées à la spectrométrie de masse sont utilisées ⋆Correspondance : Bertrand Brunet, Tél. 05 49 44 41 14, Fax 05 49 44 49 55, bertrand.brunet@chu-poitiers.fr en routine dans la plupart des laboratoires de toxicologie hos- pitaliers ou médico-légaux. Si ces techniques spéciﬁques et sensibles sont devenues indispensables, l’immunoanalyse tient toujours une place importante dans l’éventail des techniques analytiques dont dispose le toxicologue. Les avantages de l’immunoanalyse ont été largement décrits [1]. La possibilité Article publié par EDP Sciences 69 Annales de Toxicologie Analytique 2010; 22(2): 69-74 B. Brunet et coll. d’automatisation, une grande cadence et des résultats rapides sont les atouts de ces techniques largement utilisées en toxi- cologie clinique pour leur aptitude à répondre à l’urgence. La sensibilité de ces tests immunochimiques doit être adaptée à la substance à doser et la spéciﬁcité doit être maximale pour li- miter le risque de résultats faussement positifs. Les tests com- merciaux utilisables en toxicologie clinique ou en médecine légale sont validés par les fournisseurs et font l’objet d’un mar- quage CE (Communauté Européenne) garantissant leur perfor- mance sur une ou plusieurs matrices données (urine, plasma, sang total...). L’immunochimie est un ensemble de techniques diverses qui regroupe des méthodes basées sur la réaction entre un an- tigène et un anticorps. Diﬀérentes techniques ont été déve- loppées depuis les années 1970 : RIA (radio immuno assay), EMIT (enzyme multiplied immunoassay technique), EIA (en- zyme immuno assay), ELISA (enzyme linked immuno sorbent assay), FPIA (ﬂuorescence polarization immuno assay), CE- DIA (cloned enzyme donor immuno assay), immunochro- matographie... Ces techniques basées sur le même principe se classent en deux catégories suivant la présence ou non d’une étape de séparation ou de lavage permettant d’élimi- ner des substances potentiellement interférentes. Il existe donc des techniques en phase homogène sans étape de séparation (EMIT, CEDIA, FPIA) ou en phase hétérogène avec étape de séparation (RIA, ELISA, EIA) [2]. Cette distinction sera im- portante sur la capacité de ces tests à accepter diﬀérentes ma- trices ainsi que sur leur niveau de sensibilité. En eﬀet, le toxicologue peut souhaiter utiliser parfois des tests immunochimiques de manière étendue, c’est-à-dire sur une matrice non initialement prévue pour ce test. C’est le cas des laboratoires de médecine légale qui ne disposent pas sys- tématiquement d’urine ou de plasma. Souvent le sang prélevé après autopsie est de mauvaise qualité, laqué, coagulé et im- possible à centrifuger pour obtenir du plasma. Dans un but de screening pour obtenir des indications rapides, il est pos- sible d’utiliser des tests immunochimiques sur des matrices non conventionnelles. Cet article expose les diﬀérentes procédures décrites dans la littérature pour la préparation d’échantillons avant leur ana- lyse en immunochimie. Dans une première partie diﬀérentes techniques pour l’analyse du sang total sur des tests en phase homogène sont évoquées avec pour l’une d’elle, une applica- tion sur quatre paramètres importants en toxicologie (paracé- tamol, phénobarbital, digoxine et valproate de sodium). Dans une seconde partie, l’utilisation de tests immunochimiques pour l’analyse de matrices alternatives comme les cheveux, la salive, l’humeur vitrée ou les tissus est abordée. 2 Préparation d’échantillons pour analyse du sang total en immunochimie Dans de nombreux laboratoires de toxicologie ayant la double compétence en clinique hospitalière et en médecine lé- gale, les automates d’analyses en immunochimie sont des ou- tils indispensables de par leur rapidité et leur ﬂexibilité. Ils permettent le dosage de nombreux médicaments dans le sérum et la recherche de diverses drogues dans l’urine. Cependant dans de nombreux cas, notamment en médecine légale, seul le sang total (de qualité variable selon les circonstances et le délai post-mortem) est disponible. Selon le principe du test immu- nochimique, l’analyse du sang total sera possible avec ou sans préparation. En eﬀet tous les tests immunochimiques en phase hétéro- gène sont assez ﬂexibles quant à la nature de l’échantillon uti- lisé. Ceci est dû à la conception même du test qui comprend une phase de séparation entre la substance à doser qui est liée aux anticorps immobilisés sur le test et les substances interfé- rentes non liées [2]. Cette étape peut être un lavage dans le cas des tests ELISA ou microplate EIA (mEIA), une chromatogra- phie dans le cas des immunotests à ﬂux latéral ou encore une centrifugation pour les tests RIA. Les étapes de lavage sont très eﬃcaces et permettent aux tests ELISA et mEIA d’accepter di- verses matrices et notamment du sang total sans pré-traitement particulier. Toutefois ces tests sont plus coûteux que les tests en phase homogène et leur automatisation n’est intéressante que lorsque l’on eﬀectue de grandes séries. Les tests en phase homogène ne comportent pas d’étape de lavage et sont donc beaucoup plus sensibles à la nature de l’échantillon utilisé. Ils sont en général destinés à une matrice bien déﬁnie : sérum pour les médicaments, urine pour la re- cherche de drogues ou certaines classes de médicaments. Le taux de protéines, la turbidité du sérum, ou encore les résidus d’hémoglobinepeuvent perturber les tests et entraîner l’appari- tion de messages d’erreur [3]. Pour être utilisables sur d’autres matrices que celle prévue à l’origine, les procédures de ces tests vont donc devoir être adaptées. Une étape de préparation du sang total (extraction, dilution, précipitation) va devoir être pratiquée pour rendre l’échantillon utilisable. Une calibration sur la nouvelle matrice ainsi qu’une modiﬁcation des seuils de sensibilité doit aussi être envisagée. En eﬀet le seuil de dé- tection des drogues dans l’urine n’est pas compatible avec les concentrations recherchées dans le sang. De nombreuses procédures sont disponibles dans uploads/Management/ tests-immunochimiques.pdf