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Ministre de l'enseignement supérieur et de la recherche scientifique Badji Mokh

Ministre de l'enseignement supérieur et de la recherche scientifique Badji Mokhtar – Annaba University Université Badji – Mokhtar Annaba Faculté des Sciences Département de Biochimie Biochimie Appliquée BIOTECHNOLOGIE ENZYMATIQUE Présenté par le professeur: Ali LADJAMA Année Universitaire : 2020/21 Professeur A. Ladjama Email : ladjama_a@yahoo.fr Matière : Biotechnologie enzymatique (Master 1 Biochimie :coefficient 3) Sommaire Chapitre 1: Enzymologie Introduction Rappel enzymologie 1.Les enzymes : Structure, origine , site actif 2.Relation structure- fonction 1.2. Propriétés des enzymes 1.2.1. Efficacité 1. 2.3.Spécificité 1.2.4. Réversibilité 1.3. Conditions de fonctionnement des enzymes 1.4. Unité d’activité des enzymes 1.5. Classification des enzymes 2. Marché mondial des enzymes Chapitre 2 : Immobilisation des enzymes 3. Immobilisation des enzymes 3.1. Objectifs 3.2. Méthodes d’immobilisation des enzymes 3.3. Propriétés des enzymes immobilisés Chapitre 3. : Biotechnologie enzymatique 1. Définition 3. Biotechnologie blanche et biotechnologie moderne 3.1.Biotechnologie blanche 3.2.Biotechnologie moderne 3.3.Place de la bioinformatique dans la biotechnologie Chapitre IV : Les grandes applications de la biotechnologie enzymatique 1. Bioréacteurs 2. Biocapteurs 3. Domaines d’applications 1. Agro-alimentaire 2. Environnement 3. Santé Chapitre 1: Généralités Enzymologie Introduction Les enzymes savent compenser leur manque de généricité par leur extraordinaire sélectivité, voir énantiosélectivité et régiosélectivité, qui en font des outils de choix pour réaliser des réactions de synthèse dans des conditions particulièrement compatibles avec la préservation de l'environnement (milieux aqueux, pH non extrêmes, températures peu élevées). L'utilisation de plus en plus de matières premières renouvelables, donc d'origine biologique, pour favoriser des conditions de développement durable ne pourra qu'accroître les exemples de mise en œuvre de biocatalyseurs. De plus, les outils de la biologie moléculaire (PCR, Séquençage, mutation, clonage) combinés à ceux de la biologie structurale et de la modélisation « in silico » ainsi que la bioinformatique, permettent aujourd'hui non seulement de diversifier les sources de nouvelles enzymes et d'en améliorer extraordinairement l'efficacité et la stabilité, mais également de concevoir des biocatalyseurs totalement originaux, capables de réaliser de nouvelles réactions en continue. 1. Rappel enzymologie 1.1. Les enzymes : Structure, site actif ,origine et fonction -Structures fonctionnelles des enzymes (protéines de catalyse biologique) La structure primaire : est l’assemblage d’acides aminés ( au niveau du ribosomes) effectué par le processus transcription (ADN) et traduction selon le code génétique qui aboutit à une séquence bien définie. Par la suite il y a des Modifications post-traductionnelles. Les modifications post- traductionnelles conduisant aux associations de sous-unités et la mise en place de structures tertiair ou quaternaires, formation de complexes avec des glucides et des acides nucléiques, glycosylation phosphorylation, dégradation sélective. Code génétique : Si on prend un exemple, la séquence "ACC GCA AGC ATG AAT TTT TAC CTT" d'ADN (brin transcrit complémentaire) donne la séquence "UGG CGU GUC UAC UUA AAA AUG GAA" d'ARN, qui donne elle-même la séquence " Trp Arg Ser Tyr Leu Lys Met Glu" La structure secondaire cette structure se fait essentiellement par les liaisons hydrogènes .Il y a , structure en hélices et structure betta. La structure tertiaire : (ou tridimensionnelle ou conformation) correspondant au repliement de la protéine enzymatique est une structure primordiale nécessaire dans la catalyse. Fait intervenir diver liaisons chimique (fig. 1). Elle permet la formation du site actif par rapprochement des acides amin constituant dans l’espace. Cette conformation joue, également un rôle dans la protection du site act La diffraction aux rayons X a montré que l'organisation tridimensionnelle du site actif des enzymes n'est pas tout à fait la même suivant l'absence ou la présence du substrat. Ainsi, était née la théorie d de 'Conformation induite' (induced fit) où le site actif est perçu comme un 'ensemble souple' en s'adaptant exactement à la conformation du substrat. L'une des preuves expérimentales appuyant ce théorie réside dans les changements de spectres d'absorption et de fluorescence de certaines enzym présence ou en absence des substrats. Fig(1) :liaisons chimiques Fig:2: This diagram shows another enzyme with its 5 disuphide bridges in yellow and regions of α –helix in blue and betta (green). The active site is near the region of the arrows La structure quaternaire : correspond à l'association de l'enzyme en sous unités . Elle donne les derniers ajustements conformationnels. Cette structure conduit à la notion d' iso-enzymes (isozymes) qui sont des formes de la même enzyme catalysant la même réaction, mais dont certaines propriétés physico-chimiques (charge électrique, taille,…) sont différentes et c’est le cas de la lacticodéshydrogénase . (LDH) du muscle di ù 5 i -Site actif des enzymes (protéines de catalyse biologique) la catalyse enzymatique passe par la formation du site catalytique. Le site actif des enzym est une région privilégiée de l'enzyme qui interagit avec les substrats. Le site actif des enzymes est constitué d'acides aminés (AA) de 4 types: 1/ AA 'de contact', 2/ AA 'auxiliaires', 3/ AA 'collaborateurs' et 4/ AA 'non collaborateurs'. Fig (3) : Site actif Ce sont les groupements fonctionnelles des radicaux (R) des AA du site actif des enzym qui interviennent dans la catalyse. Ces groupements sont peu nombreux. Il s'agit le plus souvent des résidus SERYL, ASPARTYL ou GLUTAMYL, CYSTEYL, HISTIDYL LYSYL et accessoirement ARGINYL et TYROSYL La capacité des AA du site actif des enzymes à participer à la catalyse est liée à leur aptitude à transférer des électrons (caractère d'agents nucléophiles) et des protons (caractère acide-base selon Broensted). Le caractère de nucléophilie est plus prononcé pour la sérine, la cystéine et l'acide aspartique. Le caractère acide-base est plus prononcé pour l'histidine et la tyrosine. L'histdine intervient comme relais de proton où le noyau imidazole joue le rôle de 'renforceur' du caractère de nucléophilie des donneurs d'électrons (substrats) en captant le proton de leur OH. Ce sont finalement que quelques acides aminés de l'enzyme (AA de contact) qui sont nécessaires pour la catalyse. L'élimination de certains acides aminés n'entraîne pas la disparition de l'activité enzymatique Fig (4) :Modèle Quelques exemples •Site de fixation : Cas de la Ribonucléase ( fig4) •Site catalytique : Cas de la chymotrypsine ( protéase à serine) ou triade catalytique (fig 5 et fig6). Etude structurale de la chymotrypsine en relation avec sa fonction Fig (5) :La chymotrypsine active comprend 3 chaînes reliées par des ponts disulfures (non représentés ici). Deux des acides aminés de la triade catalytique Asp 102 et His 57 appartiennent à la chaîne B ( bleu) alors que Ser 195 fait partie de la chaîne C (vert) ainsi d'ailleurs que tous les résidus dont les chaînes latérales bordent la poche dans laquelle vient se placer ici le substrat. Quelques données concernant la chymotrypsine. -Un résidu sérine impliqué dans le mécanisme catalytique -Une triade catalytique L'étude en 3D de la structure de la molécule de chymotrypsine complexée à différents analogues du substrat (en réalité des inhibiteurs ) à permis de mieux comprendre la réactivité inhabituelle du OH du résidu Ser 195. Les modèles montrent ( fig 5 et fig 6) bien la présence dans le site catalytique, près de l'analogue du substrat, de Ser 195 mais aussi de His 57 et de Asp 102, 3 résidus qui peuvent interagir. Ils établissent entre eux des liaisons hydrogène (comme le montre l'image figure 5), ce qui entraîne notamment une polarisation plus marquée de la liaison entre les atomes O et H du groupement hydroxyle de Ser 195. Ainsi le proton, moins retenu par la Ser 195 (plus acide), est plus mobile et sera facilement cédé à His 57. L'intervention de Ser 195 est conditionnée par la présence des 2 autres résidus ( Asp et His). -Une poche essentiellement hydrophobe dans le site actif Les études tridimensionnelles montrent également la présence dans le site actif de la chymotrypsine d'une poche en grande partie hydrophobe, près de la triade. Dans cette cavité, peut venir se loger un résidu acide aminé ayant lui-même une chaîne latérale hydrophobe "volumineuse", aromatique comme Phe , Trp et Tyr ou non comme Met. En place dans la poche, le résidu est orienté de manière à placer la liaison peptidique qui sera clivée, au voisinage de la Ser 195 très réactive. Ce positionnement conditionne l'intervention de la triade catalytique. Voir modèle 3D avec triade et poche (figure 5 et figure 6) Réactions mises en jeux : Attaque nucléophile Étape 1 Etape 2 Étape3 Notion de domaine : C’est une zone globulaire compacte d’une protéine. Beaucoup de protéines se replient en plusieurs domaines ayant des masses de 10 KD à 20KD .Les domaines sont reliées par les polypeptides qui donnent une certaine flexibilité de la protéine dans l’espace. Ainsi , on peut avoir un domaine catalytique et un domaine de régulation .Le domaine N-terminal porte deux des trois acides aminés catalytiques : l'histidine 57 (H57) et l'aspartate 102 (D102) ; le domaine C- terminal porte la sérine 195 (S195). Exemple : Cas de la chymotrypsine La chymotrypsine (protéase à sérine) est constituée de trois segments d'une même chaîne polypeptidique originelle reliés par des ponts disulfure. Lorsqu'elle se replie, la chymotrypsine adopte une conformation qui correspond à deux domaines structuraux.(Fig 6 et Fig 7) Le domaine N-terminal porte deux des trois acides aminés catalytiques : l'histidine 57 (H57) et l'aspartate 102 (D102) ; le uploads/Science et Technologie/ biotechenzymatique-pptx.pdf