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4 LES TECHNOLOGIES DE LABORATOIRE - 2010, Volume 5, N°20 Article original Valid

4 LES TECHNOLOGIES DE LABORATOIRE - 2010, Volume 5, N°20 Article original Validation de la méthode du dosage de l’histamine dans les produits de la pêche par HPLC Validation Method of the Determination of Histamine Quantification in Seafood Using HPLC Abderrazzak Rachidi 1, Dina Baghdadi Mazini 2, Said Barrijal 2, Guillaume Duflos 3, Philippe Caillaud 4 1 : ONSSA - Laboratoire Régional d’Analyses et de Recherches – Casablanca; 2: Faculté des Sciences et Techniques - Tanger; 3 : AFSSA – Laboratoire d’études et de Recherches sur les produits de la pêche – Boulogne sur mer; 4 : AFNOR - EURL – Œnologues de France RESUME : L’objectif de cette étude est de valider la méthode HPLC pour le dosage des amines biogènes, l’histamine en particulier dans les produits de la pêche. Ce travail va nous permettre de quantifier de manière exacte nos échantillons et pouvoir assurer la qualité et la salubrité des produits alimentaires. Pour valider cette méthode, nous avons appliqué les exigences de la norme NF V03-110, Mai 2010 [1], basés sur le profil d’exactitude et de la fidélité et ceux de la norme NF T 90-210 [2], basés sur l’étude de la fonction étalonnage. Les résultats obtenus déclarent la méthode valide et fiable pour son usage comme méthode de routine. MOTS CLÉS : Validation interne, HPLC, Histamine, Amines biogènes, Exactitude. ABSTRACT: The aim of this study is to validate HPLC method for proportioning of the biogenic amines; particularly histamine in seafood. This work will help us to quantify in an exact way our samples and to be able to ensure the quality and the healthiness of the food products. To validate this method, we applied the requirements of standard NF V03-110 of May 2010 [1], based on the exactitude and fidelity, and the requirements of standard NF T 90-210 [2] based on the survey of the standardization .The results obtained declare the method valid and reliable for the use as method in routine. KEYWORDS : interne validation, HPLC, Histamine, Biogenic amines, Exactitude. 5 LES TECHNOLOGIES DE LABORATOIRE - 2010, Volume 5, N°20 INTRODUCTION : Selon la norme ISO 17025 [3] ; la validation est une exigence technique qui permet l’évaluation des compétences des laboratoires d’étalonnage, d’essais et d’analyses. Les principaux éléments pour la validation d’une méthode d’analyse sont (NF T 90-210) [3]: L’étude de la fonction d’étalonnage; La limite de quantification et de détection; L’étude des rendements; L’exactitude. Ce travail a été élaboré dans le but de valider le protocole expérimental de la méthode HPLC développée au Laboratoire Régional d’Analyses et de Recherches de Casablanca pour l’analyse des amines biogènes dans les produits de la pêche. 1. Domaine d’application : Ce mode opératoire décrit principalement la méthode du dosage de l’histamine (0 à 250 mg/kg) par HPLC dans les poissons frais, surgelés et en conserves. 2. Principe : Cette méthode permet de séparer et de quantifier les amines biogènes (putrescine, cadavérine, spermine, spermidine, tyramine, tryptamine et histamine) présents dans les matrices biologiques. L’extraction des amines se fait après une étape de déprotéinisation par l’acide perchlorique 0,2M elles sont marquées avec le chlorure de dansyl. Après marquage, la proline est ajoutée pour neutraliser l’excès de chlorure de dansyl. Les amines sont séparées sur une colonne C18 utilisant un gradient d’élution eau/acétonitrile. La durée de séparation chromatographique est de 30 minutes. L’analyse du chromatogramme permet d’identifier les différents pics et leurs surfaces correspondantes par une mesure à 254 nm. 3. Matériel et Méthodes : 3.1 Réactifs : • Acétone, qualité HPLC Sharlau • Acétonitrile qualité HPLC Sharlau; • Toluène qualité HPLC Merck • Acide perchlorique à 70 % p.a; • 1,3 diaminopropane;Aldrich • Carbonate de sodium pour analyse ; • Chlorure de Dansyl ; Sigma, • L-Proline. Sigma, • Histamine dihydrochloride, Fluka, PM = 184.07 g 3.2 Appareillage : Centrifugeuse réfrigérée, vortex ; Bain marie, Balance; Broyeur, pipette et tube; Evaporateur sous flux d’azote, seringue; Congélateur, Vial, flacons, filtres; Chaîne HPLC Shimadzu LC-20A Prominence. Injecteur automatique Shimadzu SIL 20 AC réfrigéré à 4°C ; Détecteur à barrettes diodes Shimadzu SPD M 20 A. 3.3 Standards de validation : Deux répétitions (n=2) ont été préparées pour chaque niveau de concentration (m=5).l’ensemble de l’étape de préparation a été répétée pendant cinq jours (p=5).Ces standards de validation (SV) ont été préparés de manière indépendante dans la matrice en vue de simuler le plus possible la procédure analytique pour la détermination des impuretés. Pour cela, un lot d’échantillon (contrôle inter laboratoire CIL-2009) a été utilisé comme matrice de contrôle. 3.4 Conditions chromatographiques : Colonne Wacosil C18 RS 5µm, 100 Å (25 cm X 4.6 mm) Phase Mobile (A : Eau /B : Acétonitrile). Suivant un gradient développé par Duflos et al [4] et obtenu par 2 pompes Shimadzu LC-20 AD. 6 LES TECHNOLOGIES DE LABORATOIRE - 2010, Volume 5, N°20 Tableau 1 : Gradient d’élution. Temps (min) Eau Acétonitrile 0 40% 60% 6 25% 75% 8 25% 75% 13 5% 95% 20 5% 95% 20.01 40% 60% 30 40% 60% Ce gradient permet de séparer les amines biogènes avec un débit de 1ml/min. L’identification des pics s’effectue à l’aide d’un chromatogramme de référence [4]. Une vérification du temps de rétention est effectuée à l’aide de la gamme d’étalonnage. Figure 1 : Chromatogramme de référence (Duflos et al 1999). 4. Outils statistiques : Macro Excel développés par Mr Caillaud Philippe (membre de la commission générale méthodes analyse agroalimentaire de l’AFNOR, EURL – Œnologues de France). 5. Résultats et discussions : 5.1. Étude de la fonction d’étalonnage : plan d’expériences de type A (NF T 90-210) Le plan d'expériences de type A permet d’évaluer une fonction d’étalonnage dans un domaine d’étalonnage par un test d’adéquation ou en comparant les biais relatifs observés à des Ecarts Maximum Acceptables (EMA). Notre plan est formé de Cinq niveaux de concentrations (étalons indépendants) préparés pendant 5 jours : p =5 et n= 5 avec deux répétitions par niveau et jour, ce qui fait un total de 5×5× 2 = 50 essais. Tableau 2 : Rapport des aires obtenues sur des étalons à des jours différents d’évaluation d’une fonction linéaire de type y = a0 + a1x niv1 niv2 niv3 niv4 niv5 Séries 0 25 50 100 250 11-Mars (J1) 0,2326 2,0527 4,0863 8,0739 20,3395 12-Mars (J2) 0,2584 2,1954 4,2608 8,1203 19,9378 15-Mars (J3) 0,2719 2,1345 4,0757 8,1185 19,2768 16-Mars (J4) 0,2527 2,1833 4,0410 8,0158 20,6128 17-Mars (J5) 0,2409 2,1679 4,0547 8,1451 19,4291 y = a0 + a1 x Séries a0 a1 CV résiduel 11-Mars (J1) 0,0899 0,0808 1,6% 12-Mars (J2) 0,2648 0,0787 0,6% 15-Mars (J3) 0,3012 0,0762 2,0% 16-Mars (J4) 0,0760 0,0817 2,8% 17-Mars (J5) 0,2754 0,0768 1,8% L’ordonnée à l’origine a0 et la pente a1 sont estimées lors de chaque jour d’étalonnage et permettent de calculer les grandeurs retrouvées de chaque étalon. Tableau 3 : Quantités d’histamine retrouvées en mg/kg niv1 niv2 niv3 niv4 niv5 Séries 0 25 50 100 250 11-mars 2,91 25,66 51,08 100,92 254,24 12-mars 3,23 27,44 53,26 101,50 249,22 15-mars 3,40 26,68 50,95 101,48 240,96 16-mars 3,16 27,29 50,51 100,20 257,66 17-mars 3,01 27,10 50,68 101,81 242,86 7 LES TECHNOLOGIES DE LABORATOIRE - 2010, Volume 5, N°20 Figure 2 : Quantités retrouvées par rapport aux quantités théoriques en mg/kg et à la droite X X = ) . Approche par vérification individuelle par rapport à un EMA (écart maximal accepté) : Les biais absolus et relatifs entre chaque grandeur théorique et chaque grandeur retrouvée doivent être calculés. Les biais observés sur chaque étalon analysé sont acceptable (± inférieurs) par rapport aux EMA fixés. Tableau 4 : Biais relatifs par rapport aux valeurs théoriques niv1 niv2 niv3 niv4 niv5 Séries 0 25 50 100 250 11-mars ---- -2,8% -1,1% -1,2% 0,3% 12-mars ---- -1,9% 1,5% -0,2% 0,0% 15-mars ---- -3,7% -0,9% 2,6% -0,3% 16-mars ---- 3,2% -2,9% -2,8% 0,5% 17-mars ---- -1,5% -1,6% 2,4% -0,3% EMA% fixé 10% 10% 10% 10% 10% Conclusion Vérifié Le choix des EMA dépend de la simulation du défaut accepté dans le domaine d’étalonnage ainsi qu’une corrélation supérieure à 0,999. Notre modèle d’étalonnage est appliqué avec un niveau ± 10%. Figure 3 : Répartition des biais en % en fonction des niveaux par rapport des EMA étalonnage définis par le laboratoire. La fonction d’étalonnage est considérée acceptable dans le domaine étudié [0-250ppm] avec l’approche EMA utilisé car les biais relatifs mesurés sont inférieurs à l’EMA fixé par le laboratoire. 5.2. Étude des rendements : plan C L’étalonnage est réalisé à partir de solutions standard ayant subies toutes les étapes du protocole analytique d’extraction. La concentration de chaque amine biogène est calculée par rapport à un standard interne (1-3 Diaminopropane) Il n’y a donc pas lieu de réaliser une étude de rendement. 5.3. Etude de l’exactitude (NF T 90-210) L’exactitude de la méthode est étudiée sur des échantillons de valeur de référence par ajouts dosés à 0,5 mg/kg, 50 mg/Kg, 100 mg/Kg et 200 mg/Kg. Les valeurs expérimentales utilisées pour l'étude de l'exactitude (plan D) à quatre uploads/Science et Technologie/383-1462-1-pb.pdf