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DE LA VALIDATION DES METHODES D’ANALYSE A L’EVALUATION DE L’INCERTITUDE DES RES

DE LA VALIDATION DES METHODES D’ANALYSE A L’EVALUATION DE L’INCERTITUDE DES RESULTATS DE MESURE Michèle Désenfant – Marc Priel – Cédric Rivier Laboratoire National d’Essais BNM-LNE 1, rue Gaston Boissier 75724 Paris Cedex 15 Résumé La norme ISO/CEI 17025 demande de valider les méthodes lorsque les laboratoires utilisent des méthodes non normalisées ou hors du domaine d'application de la norme. Ce référentiel demande également d’évaluer l’incertitude des résultats fournis. Les laboratoires d’analyses chimiques ont une longue expérience et une longue tradition de validation de leurs méthodes d’analyse mais éprouvent parfois des difficultés pour évaluer l’incertitude de leurs résultats. Dans cet article, les auteurs souhaitent faire le point sur cette notion de validation. Les performances d’une méthode peuvent s’exprimer à l’aide de caractéristiques telles que : la sélectivité, la spécificité, la justesse, la linéarité, la répétabilité, la reproductibilité, la robustesse, les limites de détection…. Ces caractéristiques s’évaluent grâce à des travaux expérimentaux, réalisés soit en interne, soit de manière collective en impliquant plusieurs laboratoires. La connaissance des caractéristiques des méthodes est une information tout à fait pertinente pour l’évaluation de l’incertitude des résultats d’analyse et les auteurs présentent leur approche pour assurer le passage des données de caractérisation à l’évaluation de l’incertitude du résultat. Abstract The ISO/IEC 17025 standard requires to validate the testing and analytical methods when they are not standardized or when standardized methods are used outside of their scope. A measurement uncertainty must also be associated with the results. Analytical laboratories have a long tradition in the process of methods validation, but some difficulties occur for the evaluation of their uncertainties. In this article, the authors want to clarify the concept of method validation and its relationship with the uncertainty of measurement. The performances of a method may be described with several characteristics as : selectivity, specificity, trueness, linearity, repeatability, reproducibility, rugdness, limit of detection…These characteristics are evaluated through experiments. The experimental works can be managed either in an internal manner in the laboratory or in an external manner with collaborative works implying several laboratories. The knowledge of the method’s characteristics is a pertinent information for the uncertainty evaluation. The authors wish to present their views and approach in order to establish a link between the characterization data and the measurement uncertainty. Validation ou caractérisation d’une méthode ? La validation se définit comme la « confirmation par examen et l’apport de preuves objectives du fait que les prescriptions particulières en vue d’une utilisation prévue déterminée sont remplies » ISO/CEI 17025 § 5.4.5.1 Il faut donc démontrer que la méthode mise en œuvre par le laboratoire est apte à l’emploi prévu (besoin du client). Il faut déterminer les besoins et attentes du client, et peut- être ne pas s’arrêter à ce qu’il spécifie. Comme la norme l’indique, il faut « élucider la demande » et considérer ce dont le client aura besoin pour utiliser l’information qui lui sera remise, examiner les exigences réglementaires et légales, et rechercher les informations nécessaires à la mise en œuvre de la méthode. Le laboratoire doit donc traduire les besoins du client en terme de performance pour les comparer ensuite avec les caractéristiques estimées de la méthode candidate. Besoins du client Méthode candidate Traduction des besoins en terme de performance de la méthode Caractéristiques de la méthode Revue de con at tr validation Fig.1 Relation entre caractérisation et validation d’une méthode Comment décrire les performances d’une méthode d’analyse ? Depuis de très nombreuses années, l’approche des analystes a été de caractériser les performances des méthodes d’analyse en évaluant au travers de travaux expérimentaux des caractéristiques. Ces caractéristiques sont décrites dans différents ouvrages tels [1] ou documents émanant de l’association européenne Eurachem [2] Voici la liste des caractéristiques les plus souvent citées : • Sélectivité, spécificité • Répétabilité • Reproductibilité • Linéarité • Sensibilité • Capacité de détection • Robustesse • Justesse Comment évaluer ces caractéristiques ? Sélectivité, spécificité Cette caractéristique est étudiée en premier, en effet elle permet de vérifier que le signal mesuré correspond bien à l’analyte recherché. La sélectivité peut se définir comme l’aptitude d’un élément de la méthode d’analyse (appareil de mesure, milieu de culture, etc.…) à discerner un analyte donné dans un mélange complexe. La spécificité est la propriété d’une méthode d’analyse de convenir exclusivement à la caractéristique ou à l’analyte, avec la garantie que le résultat de l’analyse ne provient que de l’analyte. Très souvent la spécificité se fonde sur une absence d’interférence. [3] Lorsque l’on ne peut pas évaluer l’influence de chaque constituant de la matrice, une technique commode d’emploi, permettant d’évaluer l’influence de certaines interférences, est la méthode des ajouts dosés. Elle consiste à ajouter dans l’échantillon avant, pendant ou après sa préparation des quantités connues de l’analyte. On examine alors si la réponse de l’instrument de mesure correspond au signal initial augmenté du signal correspondant à la quantité ajoutée. Les effets liés à la sélectivité et à la spécificité sont évalués globalement lors de l’évaluation de la justesse. Répétabilité et Reproductibilité (interne) Pour définir la répétabilité, il faut déjà définir la fidélité qui est l’étroitesse de l’accord entre des résultats d’essais. La répétabilité est la fidélité sous des conditions de répétabilité ; c’est à dire des conditions où des résultats d’essais indépendants sont obtenus par la même méthode sur des individus d’essais identiques dans le même laboratoire, par le même opérateur, utilisant le même équipement et pendant un court intervalle de temps. La répétabilité représente la valeur minimale de la fidélité de la méthode lorsqu’elle est utilisée par le laboratoire, elle est souvent quantifiée par un écart-type noté Sr. La répétabilité est évaluée à k niveaux de concentration (réalisés par des solutions étalons ou des matériaux de référence), en répétant n mesures. Après vérification de l’homogénéité des variances (test de Cochran) on évalue l’écart-type de répétabilité, la norme expérimentale [4] « Protocole d’évaluation d’une méthode alternative d’analyses physico-chimiques quantitatives par rapport à une méthode de référence », propose un nombre d’échantillons d’au moins k=10 et de faire au moins n=2 répétitions. Pour la reproductibilité, on note qu’il coexiste deux définitions, l’une proposée par le Vocabulaire International des Termes Fondamentaux et Généraux de Métrologie (NF X 07-001) et l’autre par la norme NF ISO 3534-1 (1993). Le traitement statistique utilisé est celui décrit par la norme NF ISO 5725 [7], le facteur laboratoire estimé avec p laboratoires, étant alors remplacé par le facteur étudié à p modalités (par exemple le temps). On note qu’il s’agit d’une reproductibilité qui est interne au laboratoire. L’écart-type de reproductibilité s’exprime par l’expression suivante : L S 2 2 r L R S S S + = Quand le nombre de répétitions est le même pour chaque modalité, cette expression se traduit par la formule suivante : ( ) ∑ =      − + − − = p j r i R n S x x p S 1 2 2 1 1 1 1 On constate dans cette expression qu’un terme provient de la répétabilité et que l’autre exprime la dispersion des résultats aux p modalités ( i x ) par rapport à la moyenne générale ( x ). Linéarité, sensibilité La linéarité et la sensibilité sont deux caractéristiques qui sont évaluées simultanément. Des expérimentations proches de ce qui a été décrit pour l’évaluation de l’écart-type de répétabilité peuvent être mises en œuvre. Le guide Eurachem préconise k=6 niveaux et n=3 répétitions, la norme XP T 90-210 propose k=5 niveaux et n=5 répétitions. Le test statistique consiste à comparer les écarts entre les moyennes des points expérimentaux et la droite estimée, à l’erreur résiduelle (c’est-à-dire la répétabilité) par une analyse de variance. L’évaluation de cette caractéristique, permet de préciser le domaine d’utilisation de la méthode en fonction de « l’erreur de linéarité » que l’on est prêt à accepter. Capacité de détection Les caractéristiques, limite de détection et limite de quantification, dont les définitions ne font pas encore l’objet d’un consensus international servent essentiellement à définir le domaine d’utilisation de la méthode d’analyse. Elles n’ont pas d’incidence directe sur l’évaluation de l’incertitude. Néanmoins, elles ont une importance sur la façon de rapporter les résultats, notamment lorsque les valeurs estimées du mesurande sont inférieures à la limite de détection. Robustesse La norme FD V 01-000 [3] propose pour définition : l’aptitude d’une méthode d’analyse à fournir de faibles variations du résultat lorsqu’elle est soumise à des modifications contrôlées des conditions d’application (exemple : température ambiante, lumière, pression atmosphérique, humidité, réactifs, appareillage, etc.…). La technique de la planification d’expérience permet d’analyser l’influence des différents facteurs qui sont supposés avoir une action sur la variable de réponse (le résultat de l’analyse). Les facteurs peuvent être quantitatifs (on fixe les différents niveaux lors de la préparation de l’expérience) ou qualitatifs (par exemple l’opérateur et on parle alors de modalité). On fait alors l’hypothèse que le phénomène peut être décrit sous la forme d’un polynôme où la variable de réponse (le résultat de l’analyse) s’exprime en fonction des facteurs susceptibles d’agir sur le processus d’analyse. l l j j x a x uploads/Science et Technologie/ de-la-validation-des-methodes-d-x27-analyse-a-l-x27-evaluation-de-l-x27-incertitude-des-resultats-de-mesure 1 .pdf