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P a g e | 1 2INTRODUCTION Un pharmacien-biologiste est un pharmacien spécialisé

P a g e | 1 2INTRODUCTION Un pharmacien-biologiste est un pharmacien spécialisé en biologie médicale, donc un professionnel de santé, qui supervise et/ou réalise les analyses et en interprète les résultats : sur des prélèvements biologiques de différents types : sang, urines, selles, liquides de ponction, à la recherche de différents éléments normaux ou pathologiques : hématologie, bactériologie, virologie, biochimie clinique, hygiène. Au cours de cette série de manipulation, il sera pour nous question de connaître les procédures de détermination de: Formule leucocytaire dont la variation renseigne sur le type d'infection auquel un patient peut être confronté Dosage de protéines dont la variation met en exergue l'activité optimale ou non du foie La coloration de gram qui est une méthode d'identification des bactéries du point de vue de leur morphologie et de leurs affinités avec le colorant. La micro dilution qui permet de déterminer la CMI et la CMB P a g e | 2 Le prélèvement Le sang exploité au cours de cette manipulation a été purement à titre expérimental. Les individus prélevés n’étaient pas forcément malade, sinon curieux de connaître leur état physiologique. La formule leucocytaire La formule leucocytaire évalue la capacité de l’organisme à répondre à une infection et à la combattre. Elle permet ainsi de détecter la présence d’une infection (bactérienne ou virale), mais également les infestations par des parasites et les réactions allergiques. Matériel Matériel Réactif Lame porte objet Lamelle Microscope Leucomètre Tube avec anticoagulant Huile à immersion Colorant de May grunwald Ethanol Eau neutre Solution de Giemsa 10% sang Technique : P a g e | 3 - Réaliser un frottis avec une goutte de sang en maintenant un angle de 45 C ⸰ - Laisser sécher à l’air libre - Verser un mL de colorant de May Grunwald, attendre 2-3 min pour que l’éthanol fixe les cellules - Ajouter autant d’eau neutre( nous avons utilisé l’eau physiologique) qu’il y’a eu de colorant( 1mL) - Verser 1ml de Giemsa dilué à 10% et attendre 30 min - Rincer à l’eau neutre - Laisser la lame sécher à l’air libre - Observer au microscope en utilisant l’objectif 100 et l’huile à immersion Résultats : 38 - Eosinophiles : 15 - Neutrophiles : 4 - Lymphocytes : 19 - Basophiles : 0 Pour des raisons techniques, la poursuite de la numération n’a pas été effectuée Interprétation Les résultats expriment le pourcentage de chaque type de leucocyte présent dans l’échantillon. Dans les conditions normales les résultats sont exprimés en terme de pourcentage comme suit : Les polynucléaires neutrophiles (50- 70%) peuvent être augmentés en réponse à une infection bactérienne, une maladie inflammatoire, un traitement corticostéroïde, ou plus rarement une leucémie. Une diminution peut résulter d’une infection grave, ou d’autres situations comme la prise de médicaments ou d’une chimiothérapie. Les polynucléaires éosinophiles (1- 3%) peuvent être augmentés en réponse à des problèmes allergiques, une infestation parasitaire ou certaines affections cutanées. Certaines infections peuvent également être impliquées, ainsi que diverses hémopathies malignes. P a g e | 4 Les polynucléaires basophiles (0- 1%) peuvent être augmentés dans certaines leucémies, les inflammations chroniques, les réactions d’hypersensibilité alimentaire, ou encore après radiothérapie. Les lymphocytes (20- 40%) peuvent être augmentés en cas d’infection bactérienne ou virale, de leucémie, de lymphome, ou de radiothérapie. Une diminution est habituelle avec l’âge, mais peut aussi refléter un traitement glucocorticoïde, un stress, un lupus ou une infection par le VIH. Les monocytes (5- 10%) peuvent être augmentés dans certaines leucémies, en réponse à toutes sortes d’infections, ou en cas de syndrome inflammatoire. Une diminution peut refléter une atteinte de la moelle osseuse, ou certaines formes de leucémies. Dosage des protéines Matériel et réactifs Matériel Réactifs spectrophotomètre UV Centrifugeuse Vortexeur Bain marie Tube à anticoagulants Seringue Sulfate de cuivre 5 fois hydraté (CuSO45H2O) Tartrate sodico potassique Iodure de potassium Eau distillée NaOH 6moles/L Étalon (7.94g/dl) Protocole Suivant le protocole, les ajouts de réactif se sont fait comme suit : BLANC ÉTALON 1 ÉTALON 2 ÉTALON 3 Tube 1 Tube 2 Tube 3 Tube 4 Réactif de Buret (mL) 2.5 2.5 1.25 1.25 Eau distillée (Ul) 50 - - - P a g e | 5 Étalon (Ul) - 50 50 - Plasma (Ul) - - - 50 Après préparation, les échantillons ont été homogénéisés avec un vortexeur puis porté au bain marie pendant 10min. Ensuite une lecture a été effectuée avec un spectrophotomètre à une longueur d'onde de 550 nm en vue d'obtenir les absorbances. Lecture des résultats Après lecture au spectrophotomètre, les résultats suivants ont été obtenus BLANC ÉTALON 1 ÉTALON 2 ÉTALON 3 Tube 1 Tube 2 Tube 3 Tube 4 Absorbance 00 2.467 2.327 2.080 Concentration 00 Courbe d'étalonnage Puisque la solution étalon est dosée à 7.94g/dL, celà équivaut à 7.94g/0.1L soit 79.4g/L Le facteur de dilution - de l'étalon 1 équivaut à F1= 2.5mL/50µl soit 2500Ul/50= 50 - de l'étalon 2 équivaut à F2= 1.25mL/50µl soit 1250µl/50= 25 Pour la solution fille de l'étalon 1, la concentration se détermine en faisant : [solution mère]= F.[solution fille] Avec [solution fille]= [solution mère]/F1= 79,4g/L/50= 1.588g/L Pour la solution fille de l'étalon 2, la concentration se détermine en faisant : [solution mère]= F2.[solution fille] Avec [solution fille]= [solution mère]/F2= 79,4g/L/25= 3.176g/L Nous pouvons récapituler les paramètres dans le tableau suivant P a g e | 6 BLANC ÉTALON 1 ÉTALON 2 ÉTALON 3 Tube 1 Tube 2 Tube 3 Tube 4 Absorbance 00 2.467 2.327 2.080 Concentration(g/L) 00 1.58 8 3.17 5 5.977 Pour déterminer la concentration de l'échantillon, nous allons nous servir de la relation Y= aX+b où a et b sont des valeurs déterminées par la relation a=∆Y/∆X= -0.14/1.588= -0.088161612091 Donc l'équitation Y= AX+B devient Y= -0.0882X + B Pour déterminer B, on part des données de l'étalon 1 où Y1= 2.467 et X1= 1.588g/L 2.467 = -0.882(1.588g/L) + B Avec B= 2.606744 D'où l'équation de l'échantillon est Y= -0.0882X + 2.607 Puisque pour l'échantillon l'absorbance est de 2.080, alors La concentration est de 5.977g/L Coloration de gram Principe La coloration de Gram est fondée sur l'action successive d'un colorant d'aniline, le cristal violet, d'iode puis d'un mélange d'alcool et d'acétone. Dans un premier temps, le colorant pénètre dans la paroi et le cytoplasme. Dans un second temps, l'iode réagit avec le colorant et le rend insoluble. L'étape suivante fait intervenir une solution d'alcool. En raison de leur paroi de structure plus épaisse et de composition chimique particulière, les bactéries Gram+ garde la coloration violette. Les bactéries Gram-, avec une paroi plus fine et plus perméable à la décoloration, perdent la couleur violette. P a g e | 7 La perméabilité plus grande des bactéries à Gram négatif à l'alcool permet la décoloration. Les bactéries Gram positif restent colorées en violet ou mauve. Une contre- coloration (par exemple en rose) permet de visualiser à nouveau, les corps cellulaires des bactéries à Gram négatif. Protocole Sur une lame, on effectue un frottis mince de l'inoculum avec une anse de platine. La lame devant être préalablement delipidé et séchée avec une la flamme afin d'éviter d'éventuelles contaminations. Après avoir séché avec la flamme, ajouter le cristal violet et laisser reposer une minute Laver à l'eau puis ajouter le lugol (un mordanceur) et laisser reposer 1mi' et laver à l'eau Décolorer ensuite avec de l'acétone pendant une minute puis colorer avec de la safranine pendant 30 secondes ou une minute Laisser sécher la lame puis ajouter une goutte d'huile à immersion puis observer au microscope optique à l'objectif 100× Schéma descriptif de la méthode de coloration de Gram Les réactifs et rôle 1. Le violet de gentiane ou cristal violet (CV) est la coloration primaire et sert à colorer les bactéries à Gram positif et à Gram négatif en violet ou en rose, respectivement. Les molécules de cristal violet sont chargées positivement et se lient aux structures de la paroi cellulaire des bactéries, chargées négativement. 2. L'iode (I) agit comme fixateur de colorant (mordant) pour fixer la coloration violette aux bactéries à Gram positif et à Gram négatif. Les molécules d'iode se lient aux molécules du P a g e | 8 violet de gentiane via des forces électrostatiques et forment ainsi un grand complexe violet de gentiane-iode insoluble (le complexe VG-I). 3. L'alcool éthylique à 95 % (l'éthanol) sert à décolorer les bactéries à Gram négatif. L'alcool dissout la membrane extérieure et perturbe la couche de peptidoglycane fine, ce qui permet aux complexes VG-I violets de traverser la paroi cellulaire de la bactérie à Gram négatif. Les bactéries à Gram positif restent violettes après la décoloration à l'alcool, puisque leur couche de peptidoglycane épaisse et solide peut résister à l'alcool et conserver les complexes VG-I. 4. La safranine sert à recolorer les bactéries à Gram négatif en rose. Comme avec le violet de gentiane, la molécule de safranine est chargée positivement et se lie aux structures de la paroi cellulaire des bactéries, chargées négativement. Les bactéries à Gram positif sont déjà colorées en violet grâce au violet de gentiane plus sombre et le restent, même uploads/Sante/la-formule-leucocytaire2.pdf