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Le Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique Univer

Le Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique Université 8 mai 1945 Faculté : S.N.V S.T.U E.G.E Département : Master1 : Microbiologie Applique Module : Méthodologie de recherche et techniques de laboratoire projet projet La chromatographie liquide à haute performance ( HPLC ) GROUPE : 03 Encadré par : Mme Hamdikane Réaliser par : BENMABROUK Manar DJAHMI Djihane MEKHANCHA Sarra 1 2019/2020 Liste des figures Fig .1 : chromatogramme d’un constituant………………………….………..10 Fig.2 : chromatogramme montrant la serapartion de trois constituant…….15 Fig.3 : courbe de Van Deemter …………………………………………….….15 Fig.4 : Principe de fonctionnement de l’HPLC……………………………….19 Fig.5 : Représentation schématique d’un système de pompage………...……20 Fig.6 : Injecteur à boucle………………...………………………………..……21 Fig.7 : Injection avec une boucle……………………………………………….22 Fig.8 : Colonne CLHP…………………………………………………………..22 Fig.9 : Colonne dans un thermostat…………………………………………....23 Liste des tableaux Tableau.1 : comparaison entre CPL et CPG…………………..……………...18 2 Sommaire Introduction CHAPITRE 1 : GENERALITE SUR LA CHROMATOGRAPHIE 1. .Définition……………………...…………………………………………….…..7 2. .Historique………………………………………………………………………..7 3. Principe …...……………………………………………………………..……. ...7 4. Classification des techniques chromatographiques…………………..……..........8 4.1Classification selon la nature physique des phases……………………………8 4.2. Classification selon le mécanisme de rétention………….………………….9 4.3. Classification selon la technique mise en jeu ………………………………9 5. Terminologie et grandeurs de rétention…..……………….…………….……….9 5.1 Chromatogramme……………………………………………………………9 5.2 . Elution ……………………………………………………………………...9 5.3 Le temps mort ………………………………………………………………10 5.4. Le temps de rétention ………………………………………........................10 5.5. Le temps de rétention réduit…………………………………………..……10 5. 6. Le volume de rétention.……………………………………………………10 5.7. Vitesse linéaire moyenne du soluté et de la phase mobile………………….11 5.8. Le facteur de capacité………………………………………………………11 5.9. Facteur de sélectivité……………………………………………………….12 6. Efficacité d’une colonne………………………………………………………...12 7. Résolution………………………………………………….……………………14 8. . Equation de Van Deemter …………………….……………………………….15 9. . Optimisation d’une analyse chromatographique ……..……………………….16 CHAPITRE 2 : GROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE (HPLC) 1. Définition……………………………………………………………………….18 2. Comparaison avec la chromatographie en phase gazeuse……………………...18 3. Appareillage.....................................................................................................…19 3.1 Réservoir de solvants……………………………………………………….20 3.2 Dispositif de dégazage……………………………………………………...20 3.3 Pompe………………………………………………………………………20 3.4 Injecteur……………………………………………………………….……21 3.5 Colonne………………………………………………………………….....22 3.6 Détecteurs…………………………………………………………………..23 3.6.1. Photomètre UV-visible……………………………………………....23 3.6.2. Réfractomètre différentiel.…………………………………………...24 3.6.3. Détecteur fluorimétrique……………………………………………..24 1.8.4 Détecteur électrochimique……………………………………………24 1.8.5 Détecteur par spectroscopie de masse………………………………...25 4. Interactions moléculaire entre phase mobile et soluté………………………….25 5. Force éluant et polarité……………………………………………………….....25 6. Classification des methodes de la clhp………………………………………....26 3 7. Application de la chromatographie à l’analyse……………………………...….27 7.1Analyse des chromatogrammes………….……………………………….….27 7.2 Analyse qualitative………………………………………………………….27 7.3Analyse quantitative……………………………………………………...….29 Conclusion Référence bibliographique 4 Introduction : La chromatographie est une méthode physique d’analyse basée sur la séparation de constituants d’un mélange ; les différents constituants de ce mélange appelés solutés sont séparés et entraînés par un fluide (un liquide ou gaz) que l’on appelle phase mobile ; ils interagissent ou au contraire n’interagissent pas avec une phase fixe que l’on appelle phase stationnaire qui exerce sur eux un effet retardateur. L'origine du mot chromatographie vient peut-être de la séparation de composés colorés puisque chroma en grec, signifie couleur et graphein signifie écrire. La chromatographie est une science très ancienne. Aristote décrit les propriétés que possèdent certaines terres pour purifier l'eau de mer. Au XVIème siècle, le strasbourgeois Brunswig purifiait de l'éthanol en faisant passer la vapeur à travers une éponge imprégnée d'huile d'olive et réalisait une expérience de chromatographie gaz-liquide, 400 ans avant la découverte de cette technique. En 1931, la publication de Kuhn et Lederer sur la séparation des isomères du carotène et de la xanthopylle apparue. En effet, c’est Kuhn qui, en 1938 reçut le Prix Nobel sur la chromatographie en phase mince. En 1952, les travaux de Martin ont mis en évidence la chromatographie d’échange ionique et en 1941 la naissance de la chromatographie de partage par Martin-Synge. En 1955 la chromatographie gaz-liquide sur le marché et en 1965 l’apparition la chromatographie liquide moderne (HPLC). L’excellente séparation des molécules, aussi bien les grosses que les petites rend la chromatographie une technique largement répandue. 5 CHAPITRE 1 GENERALITE SUR LA CHROMATOGRAPHIE 6 1. Définition La chromatographie Elle est utilisée dans divers domaines, tels que la chimie fine, la parfumerie, l’œnologie, l’industrie pétrolière, la biologie, l’industrie des matières plastiques, etc. C’est une technique d'analyse qualitative et quantitative dans laquelle l'échantillon contenant une ou plusieurs substances est entraîné par un courant de phase mobile, qui peut être liquide, gaz ou fluide supercritique, le long d'une phase stationnaire, qui peut être du papier, de la gélatine, de la silice, un polymère, de la silice greffée etc. Chaque substance se déplace à une vitesse donnée, dépendant de ses caractéristiques (polaire, non polaire, ionique, etc., et de celles des deux phases. La chromatographie est utilisée pour connaître la concentration de chaque composé d'un mélange (qualité et quantité) et même leur structure quand elle est couplée (GC-MS, LC-MS, LC-RMN, etc.). 2. Historique Le botaniste russe Mikhail Tswett (1872-1919) fut, en 1906, le premier à utiliser le terme chromatographie. À partir de 1903, Tswett utilisa des colonnes d'adsorption pour séparer des pigments de plantes. On spécula donc l'étymologie du mot chromatographie à partir du grec khrôma- pour couleur et donc pigment 3. Principe La chromatographie est une méthode de séparation des constituants d'un mélange même très complexe. Il existe trois principaux types de chromatographie : • la chromatographie en phase gazeuse (CPG) • la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) • la chromatographie en couche mince (CCM). 7 Les deux premières méthodes peuvent être assez largement décrites par des théories communes. Dans les deux cas, un fluide appelé phase mobile parcourt un tube appelé colonne. Cette colonne peut contenir des "granulés" poreux (colonne remplie) ou être recouverte à l'intérieur d'un film mince (colonne capillaire). Dans les deux cas, la colonne est appelée phase stationnaire. A l'instant initial, le mélange à séparer est injecté à l'entrée de la colonne où il se dilue dans la phase mobile qui l'entraîne à travers la colonne. Si la phase stationnaire a été bien choisie, les constituants du mélange, appelés généralement les solutés, sont inégalement retenus lors de la traversée de la colonne. De ce phénomène appelé rétention il résulte que les constituants du mélange injecté se déplacent tous moins vite que la phase mobile et que leurs vitesses de déplacement sont différentes. Ils sont ainsi élués de la colonne les uns après les autres et donc séparés. Un détecteur placé à la sortie de la colonne couplé à un enregistreur permet d'obtenir un tracé appelé chromatogramme. En effet, il dirige sur un enregistreur un signal constant appelé ligne de base en présence du fluide porteur seul ; au passage de chaque soluté séparé il conduit dans le temps à l'enregistrement d'un pic. Dans des conditions chromatographiques données, le "temps de rétention" (temps au bout duquel un composé est élué de la colonne et détecté), caractérise qualitativement une substance. L'amplitude de ces pics, ou encore l'aire limitée par ces pics et la prolongation de la ligne de base permet de mesurer la concentration de chaque soluté dans le mélange injecté. 4. Classification des techniques chromatographiques Les méthodes chromatographiques se classent en trois façons : 4.1. Classification selon la nature physique des phases Selon la nature de la phase mobile on distingue : la chromatographie en phase liquide (CPL) la chromatographie en phase gazeuse (CPG) la chromatographie en phase supercritique (CPS) Selon la nature de la phase stationnaire on distingue : la chromatographie liquide/solide (CLS) 8 la chromatographie liquide/liquide (CLL) la chromatographie gaz/solide (CGS) la chromatographie gaz/liquide (CGL) 4.2. Classification selon le mécanisme de rétention Cette classification repose sur la nature de la phase stationnaire et son interaction avec les molécules à séparer. On distingue ainsi : la chromatographie d'adsorption, de partage, d'échange d'ions, d'exclusion et la chromatographie d'affinité. 4.3. Classification selon la technique mise en je Selon la technologie mise en jeu on distingue : la chromatographie sur colonne la chromatographie de surface (chromatographie sur papier ou chromatographie sur couche mince). 5. Terminologie et grandeurs de rétention 5.1. Chromatogramme Un chromatogramme est un diagramme montrant l’évolution du signal du détecteur (par rapport à la concentration en soluté) en fonction du temps d’élution (plus rarement du volume d’élution). Ce graphique est utilisé à la fois en analyse qualitative et quantitative. Analyse qualitative : permet l’identification des composés par la position du pic Analyse quantitative : évaluer la concentration ou la masse d’un composé en utilisant l’aire des pics 5.2. Elution L’élution est l’entraînement d’un soluté à travers la phase stationnaire par le mouvement de la phase mobile. En chromatographie liquide solide, la phase mobile peut être appelée éluant. 5.3. Le temps mort 9 Le temps mot (tm) est le temps mis par un composé non retenu par la phase stationnaire de la colonne, pour parcourir le trajet entre l’entrée et la sortie de la colonne (ou temps mis par la phase mobile pour traverser la colonne). 5.4. Le temps de rétention Le temps de rétention (tr) est le temps mis par les molécules d’un composé à analyser (soluté) pour parcourir le trajet entre l’entrée et la sortie de la colonne. Le temps de rétention est caractéristique d’une espèce pour des conditions d’analyse données et peuvent servir à l’analyse qualitative. La surface et la hauteur d’un pic est fonction de la quantité du constituant. Le temps de rétention est indépendant de la quantité d’échantillon injectée. Il est fonction de la nature et la vitesse de la phase mobile (Fig.1). 5.5. Le temps de rétention uploads/Management/ methodologie-hplc-g03.pdf