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Les Anticorps Monoclonaux Dr. H. KADIRI 2020-2021 Plan • Définitions • Obtentio

Les Anticorps Monoclonaux Dr. H. KADIRI 2020-2021 Plan • Définitions • Obtentions des Anticorps Monoclonaux (AcM) • Ingénierie des AcM • Nomenclature des AcM • Applications diagnostiques et thérapeutiques Introduction L’introduction de la sérothérapie en 1890 par Emil von Behring fût à l’origine d’une nouvelle approche thérapeutique: l’immunothérapie. -> Naissance de la sérothérapie. La propriété de reconnaissance spécifique d’un anticorps en fait un outil idéal pour le traitement d’un large éventail de pathologies. En 1972, César Milstein et Georges Köhler mettent au point une technique d’hybridation lymphocytaire permettant de produire des anticorps dirigés contre un déterminant antigénique unique en quantité illimitée. -> Naissance des anticorps monoclonaux. L’introduction de la sérothérapie en 1890 par Emil von Behring fût à l’origine d’une nouvelle approche thérapeutique: l’immunothérapie. -> Naissance de la sérothérapie. La propriété de reconnaissance spécifique d’un anticorps en fait un outil idéal pour le traitement d’un large éventail de pathologies. En 1972, César Milstein et Georges Köhler mettent au point une technique d’hybridation lymphocytaire permettant de produire des anticorps dirigés contre un déterminant antigénique unique en quantité illimitée. -> Naissance des anticorps monoclonaux. Définitions Sérothérapie: Utilisation de sérums d’origine animales ou humaines contenant des anticorps dirigés contre une cible d’intérêt, dans un but thérapeutique. Sérums polyclonaux: Contenant des anticorps dirigés contre plusieurs déterminants antigéniques, qu’ils soient portés par le même antigène ou pas. Produits par plusieurs clones lymphocytaires. Sont issus d’animaux hyperimmunisés, ou de donneurs humains immunisés ou vaccinés. Exp: sérums anti-tétaniques, anti- scorpioniques, anti- hépatites B, IgIV… Sérums monoclonaux: Contenant des anticorps dirigés contre un déterminant antigénique unique. Produits par un clone lymphocytaire unique (hybridome). Sont issus de la technologie d’hybridation lymphocytaire. Définitions Anticorps monoclonaux: Les anticorps monoclonaux sont une population homogène d’anticorps produits par un clone cellulaire appelé hybridome. Ils sont conçus pour être monospécifiques: ils reconnaissent un déterminant antigénique unique. Hybridome: Une cellule hybride née de la fusion d’une cellule issue d’une lignée continue myélomateuse et d’un lymphocyte B différencié sécrétant des anticorps d’une seule spécificité. Obtention des Anticorps Monoclonaux Obtention des Anticorps Monoclonaux: L’hybridation lymphocytaire LB LB Cellule myélomateuse: • Immortelle. • Non sécrétrice d’Ig. • Porteuse de déficiences enzymatiques. Lymphocyte B activé: • Mortel • Sécréteur d’Ig. • machinerie enzymatique complète. Hybridome: • Immortel. •Sécréteur d’une Ig unique. Clonage Production d’AcM Les Techniques de Fusion • 1ère fusion (1962) par OKADA et TADOKORO : Induction de synticia dans les cultures eucaryotes. • Méthode de fusion utilisée par Köhler et Milstein en 1975. • Actuellement abandonnée. Le Virus Sendaï • La plus couramment utilisé. • PEG 1500 le plus souvent. • Simple, pratique. Le Poly-Ethylène Glycol (PEG) • Permet la fusion dirigée de deux cellules visualisées sous un microscope. • Évite l’emploi de lignées déficientes. Sélection non- nécessaire car fusion contrôlée. L’Electrofusion Les Techniques de Sélection: Les lignées cellulaires déficientes Les cellules de myélome utilisées sont préalablement sélectionnées pour leur déficience en une enzyme d métabolismes des nucléotides: l’hypoxanthine- guanine phosphoribosyl-transférase HGPRT ou, plus rarement, la thymidine- kinase TK. Les cellules eucaryotes disposent de deux voies distinctes pour synthétiser les nucléotides : • La voie de néosynthèse: à partir de sucres et d’acides aminés. • La voie de récupération: à partir de nucléosides. L’HGPRT et la TK assurent une étape essentielle de la voie de récupération. Leur déficience conduit à l’utilisation par la cellule de la voie de néosynthèse, qui peut être bloquée par des substances telles que l’aminoptérine, l’azasérine ou le méthotrexate. Les cellules de myélome utilisées sont préalablement sélectionnées pour leur déficience en une enzyme d métabolismes des nucléotides: l’hypoxanthine- guanine phosphoribosyl-transférase HGPRT ou, plus rarement, la thymidine- kinase TK. Les cellules eucaryotes disposent de deux voies distinctes pour synthétiser les nucléotides : • La voie de néosynthèse: à partir de sucres et d’acides aminés. • La voie de récupération: à partir de nucléosides. L’HGPRT et la TK assurent une étape essentielle de la voie de récupération. Leur déficience conduit à l’utilisation par la cellule de la voie de néosynthèse, qui peut être bloquée par des substances telles que l’aminoptérine, l’azasérine ou le méthotrexate. Métabolisme des nucléotides et mécanismes de sélection Les Techniques de Sélection Cellule myélomateuse: • Immortelle. • Non sécrétrice d’Ig. • HGRPRT - Lymphocyte B : • Mortel • Sécréteur d’Ig. • HGPRT + Hybridomes: • HGPRT + • Survivent en milieu HAT. Fusion LB fusionnés: • HGPRT + • Mais non- cultivables in-vitro. LB non- fusionnés: • HGPRT + • Mais non- cultivables in-vitro. Cellules myélomateuses fusionnées: • HGPRT - • Meurent. Cellules myélomateuses non-fusionnées : • HGPRT - •Meurent. Culture en milieu HAT Culture en milieu HAT Screening des Hybridomes Les clones obtenus sont ensuite testés par analyse du surnageant de culture pour mettre en évidence: – La présence des anticorps monoclonaux (Par la méthode ELISA). – Le type de l’anticorps produit . Les clones obtenus sont ensuite testés par analyse du surnageant de culture pour mettre en évidence: – La présence des anticorps monoclonaux (Par la méthode ELISA). – Le type de l’anticorps produit . Screening Identification Culture des Hybridomes Culture in vitro Les hybridomes sont faciles à cultiver in vitro: • Adhèrent mal au plastique: transfert par simple pipetage. • Pas de métabolites toxiques: renouvellement du milieu de culture par simple dilution des cellules avec le milieu frais. • A l’échelle de laboratoire, la culture se fait dans des flacons. A l’échelle industrielle, elle se fait dans des réacteurs à cellules. Culture in vivo (dans des liquides d’ascite) • La culture des hybridomes se fait dans la cavité péritonéale de souris ou de rat en association avec des substances irritantes (le pristane , adjuvant de Freund). • Choisir une souche d’animaux compatible avec les cellules parentales de l’hybridome afin d’éviter les rejets. • Pour les anticorps monoclonaux humains: souris Nude maintenue durant la production en isolateurs stériles. La découverte des anticorps monoclonaux suscita immédiatement de grands espoirs thérapeutiques. Cependant, d’importants problèmes surgirent lorsque leur utilisation chez des patients fut envisagée. L’obtention d’anticorps de haute affinité dirigée contre des cibles spécifiques pertinentes. Les propriétés effectrices des anticorps de souris ne sont pas optimales:« ADCC », activation du C’… L’apparition d’anticorps humains anti-anticorps de souris («Hama», pour human antimouse antibody). Ingénierie des Anticorps Monoclonaux AcM murins 1975 …momab AcM chimériques 1984 …ximab AcM humanisés 1988- 1991 …zumab AcM humains 1994-1999 …mumab Ingénierie des Anticorps Monoclonaux : Humanisation Immunogènes Moins immunogènes Humanisation 1. Construction d’AcM Chimériques (1984): Anticorps monoclonal murin Domaines constants d’une Ig humaine • Isoler l’ADN codant pour le domaine VH et VL d’un anticorps monoclonal murin et le lier à l’ADN codant pour les domaines constants d’une Ig humaine. • En général : • CH1,CH2,CH3 d’une IgG1 • CL d’une Kappa Toutefois, La tolérance vis-à-vis des anticorps chimériques était insuffisante  Apparition d’anticorps humains anti- anticorps chimériques « HACA ». Toutefois, La tolérance vis-à-vis des anticorps chimériques était insuffisante  Apparition d’anticorps humains anti- anticorps chimériques « HACA ». 1. Construction d’AcM Chimériques (1984): Anticorps monoclonal murin CDR’s murins CDR’s humains Ig humaine CDR’s murins • Greffe de régions hypervariables d’un AcM murin sur des régions charpentes ( Framework) VH et VL humaines (CDR grafting). •Véritable difficulté: choix des région Framework. •Objectif: garder la conformation spatiale des régions variables, éviter un changement d’affinité de l’anticorps obtenu. 2. Construction d’AcM Humanisés (1989): Souris transgéniques portant un grande partie des gènes codant pour les chaines lourdes et légères humaines. Remplacer les loci des gènes d’Ig murines par des loci des gènes d’Ig humaines. Ces souris peuvent être immunisées contre un nombre illimité d’antigènes, et fournir des LB humains comme partenaires de fusion cellulaire  hybridomes sécrétant des Ac humains. 3. Obtention de Souris Transgéniques (1994): (AcM humains) Nomenclature des Anticorps Monoclonaux Nomenclature des anticorps monoclonaux (Convention OMS 2009) Préfixe Radical A (cible) Radical B (origine) Suffixe Propre à chaque anticorps monoclonal b(a) c(i) f(u) k(i) l(i) n(e)* s(o) tox(a) t(u) v(i) Bactérienne Cardiovasculaire Fungique Interleukine Immunomodulation Neuronale Os Toxine Tumeur Virale a axo e i o u xi Xizu* zu Rat Rat/Souris Hamster Primate Souris Humain Chimérique Chimérique/Humanisé Humanisé mab mab: utilisé pour tout produit contenant un domaine variable d’immunoglobuline, qui se lie à une cible prédéfinie (n’inclut pas les protéines de fusion contenant un fragment Fc). En principe, seule la première lettre du radical A est utilisée. Sauf si le radical B commence par une consonne. International Nonproprietary Names; WHO Drug Information Vol 23, No. 3, 2009 Nom= Préfixe + Radical A+ Radical B + Suffixe Exp: Ada li mu mab u l Adalumab (si nommé après 2009) *: En discussion. Applications des Anticorps Monoclonaux Applications des AcM In vitro In vivo Tests et dosages immunologiques: Immunoagglutination. Dosages radio-immunologiques: RIA, IRMA. Immunofluorescence: IFD, IFI. Dosages immunoenzymatiques: ELISA. Immunohistochimie. Cytologie et immunotypage. Sérodiagnostique. Tests et dosages immunologiques: Immunoagglutination. Dosages radio-immunologiques: RIA, IRMA. Immunofluorescence: IFD, IFI. Dosages immunoenzymatiques: ELISA. Immunohistochimie. Cytologie et immunotypage. Sérodiagnostique.  Utilisation diagnostique en imagerie médicale. Traitement des pathologies: Tumorales. Auto-immunes. Infectieuses Allergiques. Cardiovasculaires. Rejet de transplantations.  Utilisation diagnostique en imagerie médicale. Traitement des pathologies: Tumorales. Auto-immunes. Infectieuses Allergiques. Cardiovasculaires. Rejet de transplantations. Anticorps monoclonaux à uploads/Sante/ 10-les-anticorps-monoclonaux.pdf